Анализ аутофагии в

Целью данной процедуры является индукция и наблюдение аутофагии у нитчатого гриба. Это достигается путем первоначального инокулирования небольших объемов питательной среды спорами или небольшими фрагментами мицелия. На втором этапе в лунках стеклянных предметных стекол готовятся подушечки для голодания, после чего инокулят переносят на эти подушечки.

На заключительном этапе планшеты с голодающими клетками инкубируют во влажной камере для индукции аутофагии. В конечном итоге процесс аутофагии можно отслеживать с помощью флуоресцентной микроскопии, контролируя перемещение интересующих флуоресцентных маркерных белков в вакуоли. Данный метод позволяет изучать ключевые вопросы клеточной биологии, например, поиск новых соединений, модулирующих процесс аутофагии.

Для подготовки к эксперименту по голоданию, если интересующий штамм P. cresa содержится на зеленом рисе, сначала поместите два-три рисовых зерна, покрытых сатиновым мицелием, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мкл и заполните пробирку 500 µL питательной среды GG (глюкоза с дрожжевым экстрактом). Затем перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 30 секунд, чтобы споры отделились от риса, и инкубируйте пробирку в течение одного дня при комнатной температуре. На следующий день разведите суспензию спор стерильной водопроводной водой до концентрации 1:50 и тщательно перемешайте; если P. cresa содержится на агаре.

С помощью наконечника пипетки перенесите небольшие фрагменты мицелия в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 миллилитра, содержащую 400 µL стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг стеклянных шариков. Затем перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение двух минут до фрагментации мицелия. Для культивирования PCE genum на голодательной подложке предварительно разогрейте нагревательную плитку примерно до 60 °C.

Затем растворите 2 g agarose в 100 mL водопроводной воды в микроволновой печи до полного осветления раствора, после чего охладите его примерно до 60 °C. Налейте в каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL по 400 µL стерильной водопроводной воды или раствора соединения. Затем прогрейте пробирки и предметные стекла на нагревательной плитке в течение не менее 60 секунд.

Перенесите по 400 µL агарозы с температурой 60 °C в каждую из пробирок, чтобы общий объем в каждой пробирке составил 800 µL, и коротко перемешайте их на вортексе, затем снова поместите пробирки на нагревательную płytку, чтобы предотвратить преждевременное застывание. Затем пипеткой нанесите по 140 µL соответствующего раствора агарозы в лунку каждого предметного стекла. Осторожно, чтобы не образовались пузырьки, сразу накройте агарозу покровными стеклами и оставьте предметные стекла примерно на четыре минуты.

При комнатной температуре, когда агарные подушечки затвердеют, аккуратно снимите покровные стекла с помощью большого или указательного пальца, после чего поместите предметные стекла с подушечками во влажную камеру. Затем с помощью пипетки нанесите 5 µL предварительно приготовленной суспензии P er genum в центр подушечки для голодания и поместите влажную камеру в пластиковый пакет для дополнительной защиты от высыхания, стараясь не слишком сильно перемещать контейнер, чтобы не потревожить культуры. После этого выдержите инокуляты при комнатной температуре в течение не менее 20 часов перед анализом образцов.

На следующий день перенесите предметные стекла на сухие бумажные салфетки, затем нанесите по 50 µL воды на каждую зону голодания. С помощью покровного стекла удалите излишки воды, промокнув их чистой бумажной салфеткой. После этого для каждого стекла с использованием объектива 20x получите общий обзор роста мицелия.

Для оценки локализации GFP в Hy-Fi откройте изображения, используя объектив 63 x или 100 x. В завершение, после каждого просмотра помещайте предметные стекла обратно в увлажняющую камеру до наступления следующего этапа эксперимента.

На этих изображениях штамм G-F-P-S-K-L-P Creo Genum использовался для оценки деградации пероксисом через 20 часов инкубации. GFP не наблюдался в вакуолях, и эти органеллы не были увеличены. Однако через 40 часов роста в некоторых гифах можно было визуализировать помеченные GFP ВАКУОЛИ, что указывает на активацию аутофагии; через 60 часов наблюдались флуоресценция GFP и увеличение вакуолей.

В данном эксперименте в качестве отрицательного контроля использовали мутант delta 80 G гена p caressa. Обратите внимание на отсутствие увеличения вакуолей и сигнала GFP даже через 60 часов роста, как и в случае с необработанным штаммом G-F-P-S-K-L. В качестве положительного контроля использовали рапамицин — препарат, стимулирующий аутофагию. Вакуоли, меченные GFP, стали заметны через 40 часов роста, а к 60 часам Hy-Fi был полностью заполнен крупными вакуолями, содержащими GFP.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как анализировать аутофагию у грибов рода Mentis.