Name: Анализ аутофагии в Пеницилл золотистый С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии (Видео) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Изучите метод анализа аутофагии в Penicillium chrysogenum с помощью голодных подложек и флуоресцентной микроскопии. Этот подход позволяет отслеживать транслокацию маркеров в вакуоли и изучать модуляцию аутофагии.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CQS получает стипендию от LOEWE Excellence Cluster for Integrative Fungal Research (IPF). Автор хотел бы поблагодарить Иду Й. ван дер Клей за штаммы P. chrysogenum, использованные в этой работе, и Андреаса С. Райхерта за дар рапамицина.

1. Подготовка P. chrysogenum для голодания экспериментов <ol><li> Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на рисе (&quot;зеленая рисовая &#39;), поместить 2-3 рисовые зерна, покрытые спорообразующих мицелий в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните его 500 мкл YGG (10 г / л KCl, 20 г / л глюкозы, 10 г / л дрожжевого азотистого основания, 5 г / л K 2 HPO 4, 20 г / л дрожжевого экстракта). <ol><li> Vortex трубку в течение 30 сек, так что споры могут отделиться от риса эффективно. </li><li> Инкубируйте пробирку в течение 1 дня при комнатной температуре (например, от 20 до 25 ° C). </li><li> Подготовьте разведение этой суспензии спор в стерильной водопроводной воде 1/50, хорошо перемешать. </li></ol></li><li> Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на агаровой пластине (например, YGG агаром), передавать небольшие кусочки мицелия в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 400 мкл стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг GLпопа шарики с помощью стерильного выбор зуба или пипетки. <ol><li> Вихревые трубки в течение 2 мин, так что мицелий становится фрагментированной. Сразу же использовать содержимое пробирки. </li></ol></li></ol> 2. Подготовительные шаги для выращивания Р. chrysogenum на голодном колодки <ol><li> Включите нагревательную плиту и установите его приблизительно на 60 ° C. </li><li> Растворить 2 г агарозы в 100 мл водопроводной воды при приготовлении раствора в микроволновой печи. Позаботьтесь, что это решение совершенно ясно после нагревания. Если это не так, готовить его снова до тех пор, пока агарозном растворяется полностью. Пусть раствор агарозы остыть до приблизительно 60 ° С до использования. </li><li> Заполните 1,5 мл микроцентрифужных трубки (2-4, в зависимости от количества образцов) с 400 мкл стерильной водопроводной воды каждый (никакие дополнительные соединения не добавлено) или 400-х мкл (добавление х мкл раствора соединения в стадии 2,5) и поместить их на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин, так что Watэ внутри нагревается. </li><li> Поместите микроскопа, содержащие центральную полость на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин. </li><li> Добавить 400 мкл 2% агарозном к раствору в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и вихревой кратко. После этой стадии, если желательно, дополнительные соединения (например, 1 мкМ рапамицина). Если это сделано, вихревые кратко после каждого дополнительного вещества с помощью пипетки в пробирку. Положите трубки обратно на стол отопления для предотвращения преждевременного затвердевания. ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в микроцентрифужных трубки должны быть 800 мкл. </li></ol> 3. Подготовка Предметные Содержит голода колодки <ol><li> Пипеток 140 мкл раствора агарозы в полости микроскопа (который до сих пор расположенные на нагревательной пластине). Старайтесь избегать пузыри, если это возможно. </li><li> Сразу место крышку скольжения на раствор агарозы. Примечание: Это приведет к плоской поверхности. </li><li> Поставьте микроСфера слайд на лабораторном столе в течение примерно 4 мин, чтобы позволить агарозном площадку затвердеть. </li><li> Осторожно снимите покровное из агарозы колодки, сдвинув его с помощью большого пальца или указательным пальцем (носить перчатки, чтобы избежать загрязнения!). </li><li> Поместите микроскопа с площадки во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание. Рекомендация: Используйте пустую коробку совет, который до сих пор имеет вставку для проведения наконечники. Добавить стерильную воду к коробке так, что дно покрыто. Поместите предметные стекла на вставку и закройте окно. </li></ol> 4. прививки голодание колодки с P. chrysogenum, и инкубационный <ol><li> Пипеток 5 мкл разведении 1/50 спор (если Культуры выращивали на рисе) или 5 мкл неразбавленной раствора, содержащего мицелий фрагменты (если культуры выращивали на чашке с агаром) на центр голода площадку. </li><li> Закройте мокрой камеру и оберните его в полиэтиленовый пакет (это служитдополнительная защита от высыхания голодной площадки). Будьте осторожны, чтобы не переместить окно слишком много, потому что в противном случае прививка капли будет нарушен. </li><li> Хранить завернутые коробку при КТ в течение по меньшей мере 20 ч до анализа образцов. </li></ol> 5. микроскопический анализ образцов <ol><li> После 20 ч инкубации образцы готовы для микроскопического анализа; положить стекло микроскопа на сухой папиросной бумаги (нижняя, как правило, становятся влажными). </li><li> Пипеткой небольшое количество воды (около 50 мкл) на голодной площадку. Положите покровное на площадке и выжать излишки воды. Удалить остатки воды с папиросную бумагу. </li><li> Положите стекло микроскопа на смотровой стол флуоресцентного микроскопа. Чтобы получить представление о росте мицелия, используйте цели 20X. Использование 63x или 100X цели для изучения локализации GFP в гиф. Для того чтобы предотвратить постепенное высыхание образца не анализируют образцы длябольше, чем 15 мин, прежде чем положить их обратно в мокрой камеры. </li><li> Повторите 5,3 через регулярные промежутки времени (например, после 40 ч и 60 ч роста). ПРИМЕЧАНИЕ: образец можно вернуть в мокрую камеру. Это не обязательно, чтобы удалить покровное как это не влияет на мицелия рост. </li></ol>

<ol><li>Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+quality+control%3A+an+integrated+network+of+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).</li>
<li>Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in filamentous fungi.</a> Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina%3A+a+model+organism+to+study+mechanisms+of+healthy+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing.</a> Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podospora+anserina+target+of+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Podospora anserina target of rapamycin.</a> Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).</li>
<li>Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ATG8+homologue+Aoatg8+and+role+of+autophagy+in+differentiation+and+germination+in+Aspergillus+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae.</a> Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).</li>
<li>Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+cell+death+in+Podospora+autophagy+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot.+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants.</a> Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).</li>
<li>Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+fungal+cell+death+is+necessary+for+infection+by+the+rice+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus.</a> Science. 312 (5773), 580-583 (2006).</li>
<li>Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+deficiency+promotes+beta-lactam+production+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).</li>
<li>Meijer, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomes+are+required+for+efficient+penicillin+biosynthesis+in+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).</li>
<li>Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding%2C+improving+and+using+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Understanding, improving and using green fluorescent proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).</li>
<li>Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">mTOR regulation of autophagy.</a> FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).</li>
<li>Hickey, P. C., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+living+cells+of+Aspergillus+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Imaging living cells of Aspergillus in vitro.</a> Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).</li>
</ol>

Автору нечего раскрывать.

Метод, представленный здесь позволяет удобно и воспроизводимый исследование аутофагии в Р. chrysogenum. Например, он может быть использован для скрининга эффективности различных соединений, являются ли они способны модулировать аутофагии реакцию этого гриба или нет. Результаты с рапамицином показывают, что ингибирование передачи сигналов TOR приводит к выраженной индукции аутофагии в P. chrysogenum, который также было продемонстрировано и для других организмов 11. <p class="jove_content"...

Нитчатых грибов являются Отличная модель системы для изучения процессов развития. Они предлагают несколько экспериментальных преимущества, как дешевый выращивания, высокой численности потомства и генетического доступности. Последний пункт имеет особое значение для строительства трансформантов, что позволяет исследовать важность так далеко охарактеризованных генов для различных клеточных механизмов. Мицелиальных грибов играют важную роль для выяснения нескольких элементов и механизмов клеточных путей контроля качества, как активность протеазы для деградации аберрантных белков, митохондриальная динамики для поддержания митохондриальной целостности и аутофагии для удаления излишков и / или компонентов неблагополучных клеток и для поддержания Жизнеспособность клеток во время голодания 1,2,3. Есть несколько экспериментальных методов, доступных для изучения аутофагии в нитчатых грибов 2: (I) Исследование вакуолей яF они содержат плотные тела, когда аутофагической протеазы ингибирует помощью просвечивающей электронной микроскопии 4, (II) визуализация аутофагосом по мониторингу GFP-Atg8 очаги с помощью флуоресцентной микроскопии 5,6 и (III) обнаружения подкисленных autophagosomal структур с помощью монодансил кадаверин флуоресцентный краситель 7. Здесь новый метод выращивания Пеницилл золотистый для аутофагии исследований представлены. Основным элементом является &quot;голодание колодок &#39;, который просто состоит из 1% агарозы, растворенного в стерилизованной водопроводной воды. Дополнительные соединения (например, стресс-факторы, поглотители, автофагии модуляторы) могут быть добавлены к площадке, пока они не показывают автоматического флуоресценции. Накладка находится в микроскопических слайдов, которые содержат неполную центральную полость. Это колодок в инокулировали либо суспензией спор или небольших фрагментов мицелия. Последнее целесообразно, если штамм не в интересах sporulatе эффективно (например, штаммы ГПТ1 Δ 8). Слайды расположены во влажных камерах (они могут быть легко сконструированы с использованием пипетки пустые коробки), чтобы предотвратить высыхание образца и инкубировали при комнатной температуре. П. chrysogenum может расти в течение нескольких дней в этих условиях. Аутофагия можно наблюдать микроскопически вакуолярной расширения, которая положительно маркер для грибковой аутофагии. В данной статье, в P. chrysogenum Штамм (Висконсин 54-1255) используется, который формирует зеленый флуоресцентный белок, который предназначен для пероксисом его С-концевого &quot;СКЛ&quot; последовательности 9. Поэтому можно контролировать деградацию пероксисом. Вполне возможно, для обозначения и другие отсеки клетки (например, митохондрий), используя соответствующие сигналы локализации и проанализировать их деградации. Хотя, по данным P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) представлена ​​здесь, это, конечно, возможноиспользовать метод «голод Pad &#39;и для других нитчатых грибов (например, Нейроспора густая, Sordaria macrospora, виды Aspergillus, и т.д.).

<table><tbody><tr><td>Предметные стекла для микроскопа с центральной полостью</td><td>Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия</td><td>H884.1</td><td>Их можно использовать несколько раз после очистки.</td></tr><tr><td>Стеклянные бусины</td><td>Carl Roth GmbH, Карлсруэ, Германия</td><td>A553.1</td><td>Диаметр: 0,25 - 0,50 мм</td></tr></tbody></table>

Анализ аутофагии в<em&gt; Пеницилл золотистый</em&gt; С помощью голодания колодки в сочетании с флуоресцентной микроскопии

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Изучение систем контроля качества сотовой связи стало очень динамичной и актуальной областью современных исследований. Стало ясно, что клетки обладают несколькими линиями защиты от повреждения биологически значимых молекул, таких как нуклеиновые кислоты, липиды и белки. В дополнение к динамике органелл (слияние/деление/подвижность/наследование) и жестко контролируемой активности протеазы, деградация избыточных, поврежденных или скомпрометированных органелл в результате аутофагии (клеточное «самопоедание») привлекла большое внимание научного сообщества. Регуляция аутофагии довольно сложна и зависит от генетических факторов и факторов окружающей среды, многие из которых до сих пор не выяснены. Здесь представлен новый метод, который позволяет удобно изучать аутофагию у нитчатого гриба Penicillium chrysogenum. Он основан на выращивании гриба на так называемых «подушечках голодания» для стимуляции аутофагии воспроизводимым образом. Образцы непосредственно анализируются с помощью микроскопии и оцениваются на предмет индукции аутофагии / прогресса. Представленный здесь протокол не ограничен для использования с P. chrysogenum и может быть легко адаптирован для использования при других нитчатых грибах.

Чтобы продемонстрировать полезность протокола описано выше деградации пероксисом в P. chrysogenum Штамм Ws54-1255 (GFP-SKL) анализировали. В этом штамме GFP-SKL, как правило, импортируются в пероксисомах 9. Это приводит к появлению множества сферических форм, когда образец анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. Если аутофагии происходит, вакуоли увеличить. GFP-SKL становится включены в вакуолях путем аутофагии (pexophagy). В связи с тем, что GFP устойчив к деградации вакуоли протеаз, что э...

Здесь представлен удобный и мощный метод изучения аутофагии у Penicillium chrysogenum с использованием прокладок голодания (смеси агарозы и водопроводной воды в предметном стекле микроскопа, содержащем центральную полость).

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Целью данной процедуры является индукция и наблюдение аутофагии у нитчатого гриба. Это достигается путем первоначального инокулирования небольших объемов питательной среды спорами или небольшими фрагментами мицелия. На втором этапе в лунках стеклянных предметных стекол готовятся подушечки для голодания, после чего инокулят переносят на эти подушечки.На заключительном этапе планшеты с голодающими клетками инкубируют во влажной камере для индукции аутофагии. В конечном итоге процесс аутофагии можно отслеживать с помощью флуоресцентной микроскопии, контролируя перемещение интересующих флуоресцентных маркерных белков в вакуоли. Данный метод позволяет изучать ключевые вопросы клеточной биологии, например, поиск новых соединений, модулирующих процесс аутофагии.Для подготовки к эксперименту по голоданию, если интересующий штамм P. cresa содержится на зеленом рисе, сначала поместите два-три рисовых зерна, покрытых сатиновым мицелием, в центрифужную пробирку объемом 1,5 мкл и заполните пробирку 500 µL питательной среды GG (глюкоза с дрожжевым экстрактом). Затем перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 30 секунд, чтобы споры отделились от риса, и инкубируйте пробирку в течение одного дня при комнатной температуре. На следующий день разведите суспензию спор стерильной водопроводной водой до концентрации 1:50 и тщательно перемешайте; если P. cresa содержится на агаре.С помощью наконечника пипетки перенесите небольшие фрагменты мицелия в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 миллилитра, содержащую 400 µL стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг стеклянных шариков. Затем перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение двух минут до фрагментации мицелия. Для культивирования PCE genum на голодательной подложке предварительно разогрейте нагревательную плитку примерно до 60 °C.Затем растворите 2 g agarose в 100 mL водопроводной воды в микроволновой печи до полного осветления раствора, после чего охладите его примерно до 60 °C. Налейте в каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL по 400 µL стерильной водопроводной воды или раствора соединения. Затем прогрейте пробирки и предметные стекла на нагревательной плитке в течение не менее 60 секунд.Перенесите по 400 µL агарозы с температурой 60 °C в каждую из пробирок, чтобы общий объем в каждой пробирке составил 800 µL, и коротко перемешайте их на вортексе, затем снова поместите пробирки на нагревательную płytку, чтобы предотвратить преждевременное застывание. Затем пипеткой нанесите по 140 µL соответствующего раствора агарозы в лунку каждого предметного стекла. Осторожно, чтобы не образовались пузырьки, сразу накройте агарозу покровными стеклами и оставьте предметные стекла примерно на четыре минуты.При комнатной температуре, когда агарные подушечки затвердеют, аккуратно снимите покровные стекла с помощью большого или указательного пальца, после чего поместите предметные стекла с подушечками во влажную камеру. Затем с помощью пипетки нанесите 5 µL предварительно приготовленной суспензии P er genum в центр подушечки для голодания и поместите влажную камеру в пластиковый пакет для дополнительной защиты от высыхания, стараясь не слишком сильно перемещать контейнер, чтобы не потревожить культуры. После этого выдержите инокуляты при комнатной температуре в течение не менее 20 часов перед анализом образцов.На следующий день перенесите предметные стекла на сухие бумажные салфетки, затем нанесите по 50 µL воды на каждую зону голодания. С помощью покровного стекла удалите излишки воды, промокнув их чистой бумажной салфеткой. После этого для каждого стекла с использованием объектива 20x получите общий обзор роста мицелия.Для оценки локализации GFP в Hy-Fi откройте изображения, используя объектив 63 x или 100 x. В завершение, после каждого просмотра помещайте предметные стекла обратно в увлажняющую камеру до наступления следующего этапа эксперимента.На этих изображениях штамм G-F-P-S-K-L-P Creo Genum использовался для оценки деградации пероксисом через 20 часов инкубации. GFP не наблюдался в вакуолях, и эти органеллы не были увеличены. Однако через 40 часов роста в некоторых гифах можно было визуализировать помеченные GFP ВАКУОЛИ, что указывает на активацию аутофагии; через 60 часов наблюдались флуоресценция GFP и увеличение вакуолей.В данном эксперименте в качестве отрицательного контроля использовали мутант delta 80 G гена p caressa. Обратите внимание на отсутствие увеличения вакуолей и сигнала GFP даже через 60 часов роста, как и в случае с необработанным штаммом G-F-P-S-K-L. В качестве положительного контроля использовали рапамицин — препарат, стимулирующий аутофагию. Вакуоли, меченные GFP, стали заметны через 40 часов роста, а к 60 часам Hy-Fi был полностью заполнен крупными вакуолями, содержащими GFP.После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как анализировать аутофагию у грибов рода Mentis.

analysis-autophagy-penicillium-chrysogenum-using-starvation-pads

Research

JoVE Journal

Biology

Биология

Надежный подход для контроля доставки органелл на кислых просвет дрожжей вакуоль для деградации и утилизации описано. Метод основан на конкретных маркировки целевой органелл с генетически закодированы двойного излучения флуоресценции рН-биосенсоров и визуализации отдельных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Флуоресценция Пробирной микроскопии для мониторинга Mitophagy в Дрожжи Saccharomyces CEREVISIAE

Аутофагия вездесущий процесс, который позволяет клеткам деградировать и переработку белков и органелл. Мы применяем передовые флуоресцентной микроскопии для визуализации и количественной небольшой, но существенный, физические изменения, связанные с индукцией аутофагии, в том числе формирование и распределение аутофагосом и лизосом, и их слияние в autolysosomes.

Количественный анализ Аутофагия использованием Advanced 3D флуоресцентной микроскопии

Покадровый микроскопии флуоресцентно меченных аутофагию маркеров позволяет отслеживать динамические характеристики аутофагию с высоким временным разрешением. Использование конкретного аутофагия и органелл маркеров в комбинации из 3 различных цветов, можно следовать вклада белка аутофагосом образование в прочном пространственной и временной контекст.

Живых изображений сотовый событий раннего этапа Аутофагия: Omegasomes и на последующий период

Экспериментальная сепсис могут быть вызваны у мышей с помощью слепой кишки перевязки и пункции метод (CLP). Современные протоколы для оценки аутофагию в естественных условиях в контексте CLP-индуцированного сепсиса представлены здесь: протокол для измерения аутофагию используя (GFP)-lc3 мышей и протокол для измерения образование аутофагосом с помощью электронной микроскопии.

Слепой кишки Лигирование и прокол, вызванной Сепсис как модель для изучения аутофагии у мышей

Чтобы противодействовать распространению болезнетворных микроорганизмов, клетки-хозяева реорганизовать их цитоскелета по полочкам бактерии и вызывать аутофагии. Использование Shigella инфекция тканевых культур клеток, хозяина и возбудителем детерминант, лежащих в основе этого процесса были выявлены и охарактеризованы. Использование данио модели Shigella инфекции, роль обнаруженных молекул и механизмов исследуются в естественных условиях.

Использование<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Для изучения аутофагии-Цитоскелет взаимодействий

Здесь для измерения аутофагии объективным, количественным и статистически устойчивым методом была использована мультиспектральная цитометрия проточного изображения с аналитическим признаком, который сравнивает яркие детализированные изображения 3 маркеров аутофагии и количественно их совместную локализацию, а также подсчет пятен LC3.

Оценка аутофагического потока путем измерения локализации LC3, p62 и LAMP1 с использованием мультиспектральной визуальной проточной цитометрии

Мы разработали простой и адаптации рабочего процесса для получения количественных данных из ячейки на основе изображений флуоресценции биологических исследований агрегации белков и autophagic потока в центральной нервной системе дрозофилы моделей нейродегенеративные.

Количественные клеточной биологии нейродегенеративные у дрозофилы путем объективного анализа дневно тегами белков с помощью ImageJ

В этой статье подробно описывается протокол для подготовки совместной культуры криптококковых клеток и амеб, которые изучаются с использованием неподвижных флуоресцентных изображений и изображений электронного микроскопа с высоким разрешением передачи. Здесь показано, как количественные данные могут дополнять такую качественную информацию.

Дополнительное использование микроскопических методов и флуоресценции Чтение в изучении Cryptococcus-Amoeba Взаимодействия

В настоящем протоколе описывается индукция аутофагии в жировом теле личинки Drosophila melanogaster посредством истощения питательных веществ и анализируются изменения в аутофагии с использованием трансгенных штаммов мух.

Анализ аутофагии, вызванной голоданием, в личиночном жировом теле Drosophila melanogaster

Целью этого протокола является определение аутофагических уровней в раке поджелудочной железы и ацинарных клетках поджелудочной железы с помощью иммунофлуоресценции LC3 и количественного определения точек LC3.

Оценка уровней аутофагии в двух разных моделях клеток поджелудочной железы с использованием иммунофлуоресценции LC3

В данной работе мы представляем протокол оптимизированной коррелятивной световой электронной микроскопии на срезе на основе эндогенного флуоресцентного мечения в качестве инструмента для исследования локализации редких белков по отношению к клеточной ультраструктуре. Эффективность этого подхода демонстрируется ультраструктурной локализацией эндогенного LC3 в истощенных клетках без лечения бафиломицином.

Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

Изучите метод анализа аутофагии в Penicillium chrysogenum с помощью голодных подложек и флуоресцентной микроскопии. Этот подход позволяет отслеживать транслокацию маркеров в вакуоли и изучать модуляцию аутофагии.

Анализ аутофагии в

Больше видео