Роман Атомно-силовая микроскопия на основе Биопэннинг для изоляции морфологии специфических реагентов против TDP-43 варианты, в амиотрофического латерального склероза

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать морфологические специфичные реагенты против смоляного ДНК-связывающего белка. 43 варианта, присутствующих в LS, с использованием двухфазной технологии радиопанорамирования на основе A FM. Это достигается путем предварительного подвергнутия разнообразной фаговой библиотеки нескольким раундам негативного панорамирования против нецелевых антигенов с использованием иммунопробирок.

Негативное панорамирование проводят последовательно в отношении бычьего сывороточного альбумина, агрегированного альфа-синуклеина и здоровой ткани мозга человека. Вторым шагом является завершение проверки FM после каждого набора негативного панорамирования, чтобы убедиться в успешном удалении всех нежелательных фагов. В этом примере негативного панорамирования с использованием агрегированных альфа-синуклеиновых фагов видны после одного раунда, но отсутствуют после 10-го раунда.

Затем оставшиеся раунды отрицательного панорамирования выполняются на MICA из-за ограниченной доступности образца. Фаги, реагирующие на иммуноципитированный TDP 43 из здоровых и из тканей с лобно-височной деменцией или ЛВД, удаляют последовательно. Последним шагом является выделение фагов, которые связываются с LS-осажденным иммунитетом.

TDP 43 с использованием связанных со слюдой фагов намекают на трипсин, триэтил, амин и TG one клетки. В конечном счете, специфичность этих потенциальных клонов LS проверяется с помощью непрямой fa eliza's и dot blots, гомогенизированных A-L-S-F-T-D, и здоровые ткани мозга человека иммобилизуются в обоих анализах. Обычно обнаруживается большая реактивность к LS-ткани по сравнению с другими исследуемыми группами.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с традиционным биопаннингом фагов является использование исчерпывающих протоколов негативного панирования, проверенных FM, для обеспечения выделения реагентов, которые избирательно распознают специфические для заболевания варианты белка непосредственно из сложных биологических образцов, даже если они присутствуют в низких концентрациях. Несмотря на то, что FM может дать представление об исследовании биомолекулярных особенностей и взаимодействий, он также может быть применен в других системах, таких как мониторинг прогресса биопеннинга и подтверждение специфичности одиночных CLO. Начните эту процедуру с производства фагов, как подробно описано в текстовом протоколе, чтобы сначала выполнить отрицательное панорамирование против BSA, добавьте четыре миллилитра по одному миллиграмму на миллилитр.

Раствор БСА в фосфатно-солевом буфере или PBS в 12 иммунопробирках и инкубировать в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем объедините фаговые частицы из каждой из трех библиотек, отложив небольшое количество этой фаговой смеси для последующей проверки процесса негативного панорамирования. Затем вылейте раствор БСА из первой пробирки и промывайте пробирку два-три раза PBS, чтобы удалить все несвязанные БСА, добавьте объединенные библиотеки фагов в эту первую пробирку, инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре на ротаторе перед сбором несвязанных фагов.

Имейте в виду, что важно сохранить небольшое количество фага после завершения многочисленных раундов отрицательного панорамирования против каждой мишени, чтобы убедиться в успешности процесса панорамирования, а в случае загрязнения повторяйте процесс отрицательного панорамирования с оставшимися пробирками раствора BSA каждый раз. Используйте несвязанный фаг, собранный после инкубации предыдущей пробирки. Затем проверьте удаление всех связывающих фагов BSA с помощью процедуры A FM, подробно описанной в следующем разделе видео.

Чтобы визуализировать связывание фагов с помощью FM, добавьте от 10 до 20 микролитров целевого антигена в расщепленную слюду и инкубируйте в течение 5-10 минут. Промойте MICA пять раз водой, затем добавьте от 10 до 20 микролитров фагов к MICA и инкубируйте в течение пяти-10 минут. Промойте слюду еще пять раз водой и дайте ей высохнуть на воздухе.

Выполняйте процесс FM-визуализации в режиме FM-нажатия с помощью наноскопа 3, контроллера на воздухе при комнатной температуре. Кремниевые FM-зонды имеют резонансную частоту 300 килогерц и пружинную постоянную 40 ньютонов на метр. Вставьте наконечник FM в загрузчик наконечников.

Прикрепите загрузчик наконечников к FM-микроскопу. Поместите образец под микроскоп A FM. С помощью ручек выровняйте лазер по наконечнику A FM.

Установите частоту сканирования на 3,05 Гц и разрешение сканирования на 512 образцов на линию. Автоматическая настройка машины для оптимизации вибрации диоксида кремния. Частота нажатия наконечника, инициируйте сканирование образца.

Наконечник будет сканировать поверхность MICA, измеряя высоту связанного фага. Фаги представляют собой длинные белые линии, которые следуют за процессом получения изображений путем базового сглаживания фона, чтобы гарантировать, что все размеры частиц сопоставимы в каждом изображении. Ширина фага может варьироваться от изображения к изображению из-за других размеров частиц и области сканирования, но это никогда не повлияет на точность связывания фага с антигеном.

Изображение сглаживается в 2D-изображение, а плохо прорисованные области, вызванные загрязнением ПЭГ, выделяются для исключения из будущего анализа данных. Иммуно преципитирует здоровый белок TDP 43 из здоровой ткани мозга человека, как описано в текстовом протоколе, за счет меньшего количества иммунопреципитированного белка. Проведите эти раунды отрицательного панорамирования с использованием слюды, сначала расщепите восемь поверхностей слюды до первой слюды с содержанием примерно 100 микролитров иммуноосажденного белка и инкубируйте в течение 5-10 минут при комнатной температуре после инкубации.

Промойте СЛЮДУ пять раз 0,1% фосфатным буферным раствором с 20 сокращенно PBST. Затем добавьте примерно 100 микролитров фага после отрицательного воздействия на здоровую ткань мозга человека и инкубируйте в течение 5-10 минут при комнатной температуре. На полпути инкубации добавьте иммуноципитированный белок ко второй слюде.

Соберите фаг из первого MICA перед пятикратным промыванием MICA с 0,1% PBST. Промыв вторую слюду, добавьте ранее собранный фаг. Повторяйте весь процесс до тех пор, пока фаг не будет отрицательно обработан против всех восьми слюд с иммуноципитированным белком.

Проверьте успешность процесса панорамирования с помощью фага после первого и восьми раундов негативного панорамирования с помощью FM, чтобы начать иммуноципитацию белка TDP 43 из мозга людей с LS, как описано в текстовом протоколе, расщепите три поверхности MICA. Затем добавьте 50 микролитров A LS TDP 43 в первую слюду после пятиминутной инкубации при комнатной температуре. Промойте СЛЮДУ пять раз с 0,1% PBST.

Далее добавьте в СЛЮДУ 50 микролитров фага, собранного после отрицательного панорамирования против здорового TDP 43, и инкубируйте в течение пяти минут. Соберите несвязанные фаги. Важно хранить все собранные фаги на этих этапах панорамирования отдельно.

Далее соберите связанные фаги с помощью трех элюцианских методов. Сначала добавьте в каждую СЛЮДУ по 50 микролитров трипсина и выдерживайте не более 10 минут. Соберите раствор и сэкономьте.

Далее добавьте в каждую СЛЮДУ по 50 микролитров 100 миллимолярного триэтиламина и инкубируйте не более 10 минут. Соберите раствор в равном объеме одного моляра трис HCL буфера pH 7,4 и сохраните треть, добавьте 50 микролитров TG one клеток непосредственно в СЛЮДУ и инкубируйте в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия. Кроме того, добавьте фаги, собранные с помощью первых двух элюцианских методов, к 100 микролитрам TG 1 клеток в той же концентрации и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Далее повторите этот процесс со второй слюдой. Возьмите собранный несвязанный фаг с помощью первого MICA с A LST DP 43 и добавьте его ко второму MICA с A-A-L-S-T-D-P 43 и инкубируйте в течение пяти минут. Объедините TG one клетки, инфицированные фагами, с трипсином из каждого A LST DP 43 MICA и пластину на всей пластине Бурани Бурани с ампициллином или пластиной LBA.

Повторите тот же процесс для триэтиламина и TG 1 аллагов из двух наборов A LS TDP 43 MICA, всего три планшета. Повторите все шаги с третьей слюдой A LS, однако в этом случае используйте фаг, собранный после двух раундов негативного панорамирования против лобно-височной деменции. T DP 43 помещают инфицированный TG в одну клетку на три планшета LBA и инкубируют в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день. Подсчитайте количество колоний на шести пластинах LBA с потенциальными клонами LS. На трех планшетах LBA из третьего A LS MICA должно быть меньше колоний по сравнению с тремя планшетами LBA после двух раундов положительного панорамирования с использованием фага после отрицательного панирования против здорового TDP 43 получить фаг и растворимые фрагменты антител с вариабельным доменом одной цепи или sCV из этих клонов и проанализировать с использованием различных иммунологических анализов для проверки специфичности к ткани LS.

FM-визуализация используется для мониторинга негативных этапов панорамирования по отношению к различным мишеням, чтобы убедиться, что все реактивные фаги удалены. Результаты FM показали связывание фагов после одного раунда негативного панорамирования против агрегированного альфа-синуклеина и отсутствие связывания после восьми раундов. Отрицательное панорамирование здоровой ткани мозга человека проводилось для удаления фагов, связывающих многие антигены, присутствующие в гомогенате здорового человеческого мозга.

Здесь показано связывание фагов со здоровыми тканями после одного раунда негативного панорамирования и отсутствие связывания фага после 10 раундов негативного панорамирования. После получения фага и растворимого SCFE из потенциальных клонов, они были протестированы на непрямой Eliza на специфичность к LS-ткани. Почти все фаги показали предпочтение LS-ткани перед здоровой.

Аналогичные результаты получены при сравнении связывания фага с LS с лобно-височной деменцией или FTD тканью. Сравнение связывания SCFV с LS-тканью как в здоровой, так и в FTD ткани снова показало селективное связывание с LS-тканью почти у всех клонов. Иммуноферментный анализ методом дот-блот был использован для дальнейшей проверки связывания с тканью LS, а также для выяснения того, какие клоны являются реактивными в других иммунологических приложениях.

Здесь показано связывание второго клона с тканью LS. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как применять биопа на основе FM для выделения реагентов против заболевания, конкретной мишени интересов, реагентов, которые могут служить потенциальными диагностическими и/или терапевтическими инструментами.