Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать три различных метода ПЦР в реальном времени, основанных на зондах, используемых для количественного определения микроРНК в образцах плазмы и сыворотки. ПЦР на основе зонда в реальном времени достигается путем гидролиза и обнаружения флуоресцентно меченного зонда, который содержит флуоресцентный репортер и гаситель. Когда липкая полимераза распространяется от предшествующего праймера и достигает пятого первичного конца зонда, это приводит к физической диссоциации флуоресцентного излучателя от гасителя.

Затем высвобождается одна молекула флюоресцентного 4, которая регистрируется детектором и представляется как постепенное увеличение флуоресцентного сигнала от этой реакции. В конечном счете, количество полученного продукта ПЦР может быть измерено на основе увеличения флуоресценции, что позволяет точно количественно определить амплификацию амплификации мишени. Этот метод становится многообещающим методом для открытия новых биомаркеров для различных видов рака и других заболеваний, таких как диабет.

Хотя этот метод может дать представление о распространенности микроРНК в сыворотке и плазме, он также может быть применен к другим образцам, таким как периферические клетки и ткани. Визуальная демонстрация этого протокола имеет решающее значение, поскольку некоторые шаги, связанные с герметизацией предметного стекла нанофлюидной матрицы, может быть трудно освоить, просто прочитав протокол Для обнаружения зрелых микроРНК в режиме реального времени на основе зонда при 4,2 микролитрах индивидуального реагента QPCR смешивается с каждой лункой оптического 96-луночного планшета. с последующим вводом 0,8 микролитра соответствующего свежеприготовленного реакционного раствора КДНК. Запечатайте планшет соответствующей оптической крышкой, а затем запустите QPCR на системе ПЦР в реальном времени.

Чтобы получить микрофлюидную матрицу с начальным вводом от 1 до 1000 нанограммов общей РНК, сначала разморозьте буфер праймеров бассейна А и В, дезоксинуклеотидфосфаты, хлорид магния и ингибитор РНК на льду. Затем для проведения обратной транскрипции необходимо ввести 100 нанограммов каждого образца РНК в пробирку бассейна А или бассейна В, после чего следует добавление соответствующего объема воды, свободной от нуклеаз, чтобы довести общий объем в каждой пробирке до трех микролитров. Далее 4,5 микролитра соответствующего реактива обратной транскрипции смешать в соответствующие пробирки.

Затем поместите образцы в амплификатор и начните обратную транскрипцию. Пока идет обратная транскрипция. Для общего количества входных образцов РНК от одного до 350 нанограммов разморозьте заранее определенный пул праймеров предварительного амплификации на льду, когда образцы будут готовы, добавьте 22,5 микролитра соответствующего реагента для предамплификации.

Смешайте с пробирками бассейна А и бассейна В и добавьте по 2,5 микролитра образца обратной транскрипции CDNA в каждую. Затем загрузите образцы в амплификатор и запустите цикл предусилителя. В конце цикла добавьте 75 микролитров 0,1 x трис ЭДТА буфера в предварительно амплифицированную CDNA, чтобы загрузить микрофлюидную карту.

Затем добавьте 450 микролитров смеси реагентов QPCR к девяти микролитрам разбавленной PREPL амплифицированной CDNA для карты А, используйте продукт PREPL с амплификацией, приготовленный с использованием праймерной пулы А, и добавьте 441 микролитр воды, не содержащей нуклеаз, до конечного объема 900 микролитров. Затем, когда она нагреется до комнатной температуры, извлеките карту с матрицей низкой плотности из упаковки и положите ее фольгированной стороной вниз на чистую поверхность. Добавьте 100 микролитров ПЦР-реакции.

Смешайте с каждым из восьми заливных отверстий на карте. Вращайте карту в течение одной минуты при 331 GS и комнатной температуре. Затем медленным, равномерным и равномерным движением протолкните каретку поперек карты, пока она не достигнет конечной точки запечатывателя.

Извлеките запечатанную плату массива и отрежьте резервуары. Затем убедитесь, что в системе микрофлюидики для ПЦР в реальном времени установлены правильная крышка с подогревом блока и держатель образца. Чтобы загрузить наножидкостные матрицы, разморозьте разведенный препл, амплифицированный CDNA и прихватите реагент QPCR в реальном времени.

Перемешивайте и перемешивайте флакон с реагентом QPCR, вращая. Далее добавьте 22,5 микролитра смеси реагентов QPCR к 22,5 микролитрам разбавленного препл, амплифицированного CDNA. Затем добавьте по пять микролитров каждого образца в восемь лунок 384-луночной пластины для образцов наножидкостного массива, позаботившись о размещении бассейна А и бассейна В каждого образца.

В соседних восьми луночных блоках, когда все образцы будут перенесены, покройте каждую секцию пластины кусочками герметика для образцов с открытым массивом. Затем разморозьте первый слайд нано-жидкостного массива до комнатной температуры примерно через 15 минут. Подтверждено, что в системе nano fluidics array установлены правильные крышки для редактирования блока и держатель образца, а затем ослабьте поршень шприца с иммерсионной жидкостью с легким потягиванием.

Снимите колпачок, поставьте наконечник на место и промойте воздух с наконечника. Затем поместите наконечники системы загрузки внутрь системы загрузки. Откройте крышку и поместите планшет с образцом в загрузочную систему.

Теперь наденьте пару плотно прилегающих перчаток. Осторожно откройте упаковку с предметным стеклом и медленно вытащите предметное стекло из упаковки, не касаясь верхней части. Поместите предметное стекло в загрузочную систему со штрих-кодом слева.

Затем снимите запайщик с той части пластины для образца, которая предназначена для загрузки, и используйте программное обеспечение системы загрузки для ввода положения слайда со штрих-кодом, положения образца и конфигурации наконечника. Во время загрузки затвора снимите прозрачный красный пластик с нижней части крышки задвижки. Затем осторожно снимите и закройте предметное стекло в течение 90 секунд после окончания процесса загрузки.

Поместите предметное стекло в зажим для пластины, а крышку задвижки на предметное стекло на 30 секунд, убедившись, что крышка расположена таким образом, что штрихкод отображается правильно. Затем поместите шприц с погружной жидкостью внутрь предметного стекла так, чтобы наконечник прижимался к крышке, и медленно заполните предметное стекло погружной жидкостью, следя за тем, чтобы жидкость текла по крышке. Как только затвор заполнится, запечатайте его заглушкой, поворачивая винт до тех пор, пока ручка не сломается.

Наконец, снимите пластиковую крышку в верхней части крышки и осторожно поместите предметное стекло в держатель предметного стекла системы ПЦР в реальном времени. Следите за тем, чтобы поддерживать нижнюю часть горки во время ее опускания, не касаясь верхней части горки. Затем инициализируйте систему ПЦР и запустите программу количественной ПЦР в течение одного часа после загрузки образцов.

Используя эту процедуру, реакционный объем в пять микролитров может дать результаты, аналогичные тем, которые достигаются при использовании объема в 20 микролитров с сильной корреляцией. Здесь показано до 39 циклов, мягкие графики Альтмана и корреляции для всех 754 микроРНК, протестированных на одном и том же образце с использованием карт микрофлюидики, поскольку только что продемонстрированные микроРНК со значениями СТ от нуля до 19,99 в обоих следах также демонстрируют аналогичную экспрессию с коэффициентом детерминации 98%. Кроме того, количество микроРНК со значительными различиями, наблюдаемыми между испытаниями, увеличивается при выборе значений СТ от 30 до 40. На этом графике показаны данные платформы нано-флюидных матриц для всех 754 микроРНК.

Важно изучить кривые амплификации, чтобы убедиться, что полученные результаты указывают на истинную амплификацию. Хозяйственные микроРНК, такие как U six, также должны быть исследованы на предмет вариабельности. Например, на этом графике показана типичная кластеризация из U шести реплик с низким стандартным отклонением, указывающая на надежность данных.

Наконец, эти данные иллюстрируют повышенную вариабельность реплик U six во второй выборке. Высокопроизводительные технологии на основе зондов, такие как микрофлюидика и матрицы Nana Fluidics, позволяют легко и эффективно обнаруживать содержание нескольких микроРНК в большом количестве образцов за очень короткое время. Каждый из рабочих процессов рассчитан на различную производительность в зависимости от количества мишеней микроРНК и количества анализируемых образцов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять различные методы ПЦР в реальном времени на основе зондов для определения содержания микроNA.