Са изображений

Общая цель данной процедуры заключается в регистрации сигналов кальция в фоторецепторах-колбочках сетчатки мыши, вызванных световым стимулом, с помощью флуоресцентного биосенсора. Это достигается путем выделения сетчатки из трансгенной линии мышей, в которой генетически кодируемый сенсор кальция экспрессируется исключительно в фоторецепторах-колбочках. Вторым этапом является изготовление вертикальных срезов ткани сетчатки.

Затем срезы сетчатки закрепляют на покровных стеклах и помещают под двухфотонный микроскоп. Заключительный этап заключается в регистрации кальциевых сигналов от отдельных синаптических окончаний колбочек-фоторецепторов в ответ на световую стимуляцию. В конечном итоге зарегистрированные кальциевые сигналы анализируются в автономном режиме.

С помощью данного метода мы можем одновременно регистрировать активность многих фоторецепторов кукурузы с субклеточным разрешением. Это является основным преимуществом перед существующими методами, такими как электрическая регистрация с отдельных клеток, которая более сложна и трудоемка. Таким образом, вопрос, на который мы хотим ответить, заключается в том, участвует ли кальций в дегенерации фоторецепторов и каким образом.

Данный метод позволяет определить, является ли приток кальция причиной дегенерации фоторецепторов или же это следствие гибели клетки. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с трудностями главным образом из-за необходимости сохранения светочувствительности сетчатки, в связи с чем все деликатные этапы, включая диссекцию сетчатки и получение срезов, должны проводиться при зеленом или красном свете. Для начала процедуры перенесите глазное яблоко мыши в чашку Петри с охлажденным и насыщенным карбогеном внеклеточным раствором.

Проколите глазное яблоко в любой точке по границе между роговицей и склерой с помощью острой иглы для инъекций. Затем зафиксируйте глаз за склеру пинцетом и осторожно введите одно лезвие ножниц в отверстие. Разрежьте по зубчатому краю (ora serrata), чтобы отделить переднюю часть глаза от глазной чаши.

Затем сделайте радиальный разрез чашечки глаза в месте метки маркером, чтобы обозначить дорсальную позицию сетчатки. После этого расположите чашечку глаза так, чтобы дорсальный разрез был направлен в противоположную сторону. Захватите склеру с левой и правой стороны чашечки глаза, введя кончики пинцета между сетчаткой и склерой.

После этого отделите сетчатку, осторожно вывернув склеральную часть iica. В завершение перережьте зрительный нерв, чтобы освободить сетчатку от склеры. Зажмите край сетчатки пинцетом и с помощью второго пинцета аккуратно удалите остатки тканей и стекловидное тело с поверхности сетчатки.

Когда поверхность сетчатки будет очищена, сделайте три дополнительных радиальных разреза меньшей длины. Теперь медленно погрузите предметное стекло в экстрацеллюлярный раствор рядом с тканью. Осторожно перетяните сетчатку на предметное стекло стороной ганглиозных клеток вверх, захватив ее за край, чтобы минимизировать механические повреждения и складывание ткани.

Затем с помощью изогнутого лезвия скальпеля вырежьте из выбранного участка сетчатки прямоугольник размером примерно 1 × 2 мм и удалите излишки раствора вокруг ткани. Затем поместите предварительно подготовленную нитроцеллюлозную волокнистую мембрану поверх фрагмента сетчатки так, чтобы сторона с ганглиозными клетками прилегала к мембране. Немедленно добавьте каплю внеклеточной среды на мембрану, чтобы плотно закрепить на ней ткань.

Перенесите закрепленную на мембране ткань сетчатки в камеру для нарезки, содержащую свежий внеклеточный раствор. Затем нарежьте сетчатку вертикальными срезами толщиной 200 micrometer. С помощью прибора для нарезки тканей (tissue chopper) приклейте один закрепленный на мембране срез к стеклянному покровному стеклу, предварительно подготовленному с использованием вакуумной смазки.

Следите за тем, чтобы стеклянная поверхность под сетчаткой была чистой и обезжиренной. После этого добавьте каплю внеклеточного раствора к каждому срезу на покровном стекле, помещенному в камеру для удержания при комнатной температуре. Подавайте карбоген в камеру путем барботирования небольшого резервуара с водой, чтобы поддерживать увлажненную атмосферу в камере для удержания.

Оставьте срезы в приемной камере на 10–15 минут перед тем, как поочередно переносить их в регистрационную камеру. Перенесите срез из приемной камеры в регистрационную и немедленно начните его перфузию карбонизированным внеклеточным раствором. Поддерживайте скорость потока перфузии 2 мл/мин и температуру 37 °C.

В регистрирующей камере. Используйте объектив с водной иммерсией 20 x 0,95 NA и ПЗС-камеру в сочетании с инфракрасным светодиодом под регистрирующей камерой. Для поиска среза сетчатки запустите систему двухфотонной визуализации в соответствии с инструкциями производителя.

Затем включите лазер и установите длину волны 860 нанометров. Включите два канала детектирования для флуоресцентной визуализации ECFP и цитрина. Далее с помощью программного обеспечения для сбора данных управляйте двухфотонным микроскопом, чтобы просканировать и выбрать ряд терминалей колбочек для записи; установите параметры сбора изображений на 128 × 16 пикселей или аналогичную конфигурацию, ограничив область сканирования терминалями колбочек, чтобы избежать выцветания фотопигментов в наружных сегментах.

Включите лазер. Перед подачей световых стимулов или применением фармакологических агентов дайте колбочкам адаптироваться к сканирующему лазеру и фоновому свету стимула в течение 20–30 секунд. Теперь начните предъявление произвольных стимулов.

Стимулы генерируются путем модуляции интенсивности двух светодиодов во времени с использованием микропроцессорной платы, управляемой специализированным программным обеспечением. Затем начинается одновременная запись двух каналов флуоресценции с помощью соответствующего программного обеспечения для сбора изображений. Запись велась с фокусировкой на синаптических терминалях колбочек-фоторецепторов в срезах сетчатки.

Это пример записи области с семью отдельными терминалями. Флуоресценция регистрировалась с использованием двух каналов: одного для FRET-акцептора citrine и одного для FRET-донора ECFP. Здесь показаны вызванные светом изменения флуоресценции citrine и ECFP, записанные в одной области интереса.

Здесь представлены кальциевые ответы терминала колбочки на серию односекундных вспышек яркого света с интервалом в пять секунд. На этом рисунке показан пример количественного анализа кальциевых ответов колбочек, вызванных светом. А здесь представлены кальциевые ответы, вызванные светом, от одного терминала колбочки.

На данном рисунке показано определение среднего кальциевого отклика. Уровень кальция в покое представляет собой базовую линию до световой стимуляции, а величина отклика ra — это площадь между уровнем кальция в покое и пиковой амплитудой, а также между кинетикой начала и завершения отклика. Данная процедура может быть расширена.

Например, сигналы кальция в фоторецепторах могут существенно меняться при различных фармакологических воздействиях или сильной стимуляции, что позволяет исследовать такие процессы, как адаптация, или детально изучать отдельные этапы фототрансдукции. Данный метод позволяет исследовать динамику кальция в колбочках при нормальных физиологических условиях. Это особенно важно для понимания механизмов первичной и вторичной дегенерации колбочек при заболеваниях, приводящих к слепоте у людей, таких как акротопия или пигментный ретинит.