Визуализация

Общая цель следующего эксперимента — продемонстрировать воспроизводимый протокол формирования микропоражений миокарда, вызванных ESMO, в сердце инфицированных мышей. Это достигается путем инфицирования мышей ESMO и обеспечения развития бактериемии, что дает бактериям доступ к сосудистой системе сердца, где они могут проникать в миокард и формировать микроскопические поражения. Затем сердца либо заливают в парафин с последующим традиционным окрашиванием, либо фиксируют в соединении OCT для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Анализ окрашенных срезов может выявить микроповреждения миокарда, случайным образом распределенные по всей ткани, отложения коллагена, восстанавливающиеся участки миокарда и капсулы пневмококков внутри микроповреждений сердца. Демонстрация процедуры. Арман Браун — аспирант моей лаборатории. Данный метод позволяет получить представление о повреждающем воздействии S. pneumonia на сердце при инвазивной пневкокковой инфекции у мышей.

Этот метод также может быть применен к образцам сердечной ткани из других систем, например, от людей или нечеловекообразных приматов. Начните с выращивания штамма ESMO Serotype four Tiger four в бульоне Тодда-Хьюитта до достижения оптической плотности 0,5 при 620 нанометрах. При достижении нужной плотности осадите культуру центрифугированием при 3 500 G в течение 10 минут.

Затем удалите супернатант с помощью вакуумной линии и ресуспендируйте бактерии в стерильном PBS до концентрации 10 000 колониеобразующих единиц на миллилитр. Теперь анестезируйте мышей линии valve C в возрасте от 10 до 12 недель и подтвердите состояние анестезии, осторожно сжав пальцы лапы тупым пинцетом; наберите в шприц бактериальную суспензию и установите иглу калибра от 27 до 30 G. Затем одной рукой зафиксируйте анестезированную мышь, удерживая ее за загривок, а другой рукой введите внутрибрюшинно 100 µL суспензии; поместите каждую мышь обратно в клетку.

Мыши обычно пробуждаются через 30–40 секунд после инъекции. Точное соблюдение дозировки S. pneumoniae имеет решающее значение, иначе мыши могут либо выздороветь после инфекции, либо заболеть инвазивной пневмококковой болезнью слишком быстро, что помешает развитию очагов поражения. Поскольку разные бактериальные штаммы обладают различной степенью вирулентности, определение правильной дозы может потребовать метода проб и ошибок.

Позвольте инфекции развиваться в течение как минимум 24 часов для достижения ранней стадии или до 30 часов для продвинутой стадии инфекции. Затем подвергните каждую инфицированную мышь эвтаназии. Сначала возьмите пробу крови: продезинфицируйте хвост спиртовой салфеткой и отсеките участок длиной от двух до трех миллиметров.

Соберите 2 µL крови из места надреза. Выполните десятикратные серийные разведения крови в PBS, содержащем гепарин натрия в концентрации 1 U/mL. Высейте пять уровней разведений на чашки с триптиказо-соевым кровяным агаром и инкубируйте их в течение ночи.

На следующий день проведите подсчет колоний. Приступайте к забору сердца, как описано в следующем разделе. В качестве альтернативы — через 30 часов после заражения.

Попытайтесь спасти мышь, введя ампициллин внутрибрюшинно в 100 µL физиологического раствора. Продолжайте вводить ампициллин каждые 12 часов в течение 36 часов, после чего извлеките сердца в заданные моменты времени. Сначала проведите забор сердца.

Поместите эвтаназированную мышь в положение на спине на хирургическую платформу, обработайте грудную клетку 70%этанолом и промокните насухо. С помощью хирургических ножниц и пинцета вскройте грудную полость. Удалите ребра и пересеките диафрагму, чтобы обнажить сердце и легкие.

Затем перережьте кровеносные сосуды, подходящие к сердцу, и с помощью пинцета осторожно извлеките сердце, избегая повреждения тканей. Промойте сердце в PBS и поместите его в кассету для сбора образцов тканей для подготовки корональных срезов. Затем перенесите кассеты в 10% раствор буферизированного формалина, а на следующий день отправьте их на парафинизацию.

На ранних стадиях сердечные поражения можно идентифицировать по изменению их цвета, а в некоторых случаях — по наличию иммунных клеток. В продвинутых поражениях иммунные клетки отсутствуют, а на их месте обнаруживаются крупные образования, подобные сосудистым аномалиям (VA).

Используя срезы сердца толщиной 5 µm на положительно заряженных предметных стеклах, сначала заморозьте срезы, затем разморозьте их и дайте им высохнуть на воздухе. Фиксируйте стекла в 10% нейтральном буферном формалине в течение 10 минут при 25 °C. Затем удалите фиксатор, промыв трижды в PBS по 5 минут за каждую промывку.

Затем проведите пермеабилизацию ткани 0,2% раствором Triton X 100 в PBS в течение 15 минут. Удалите детергент, выполнив еще три промывки чистым PBS. После этого заблокируйте ткань 10% сывороткой с коатом в PBS в течение одного часа, промойте в PBS и инкубируйте срез с антисывороткой в течение двух часов при 37 °C.

Обработайте отрицательные контроли наивной антисывороткой кролика. Поскольку ткани сердца легко поглощают иммунофлуоресцентный краситель XI, что приводит к высокому уровню фонового сигнала, концентрацию и время инкубации для различных типов антител, вероятно, потребуется оптимизировать. Через два часа удалите антисыворотку, промыв препарат раствором PBS. Затем замените раствор вторичными антителами и инкубируйте стекла при 37 °C в течение 30 минут. После этого нанесите DPI в концентрации 5 mg/mL и промойте стекла раствором PBS.

Наконец, закрепите стекла, сохраните их и проведите визуализацию с помощью конфокальной микроскопии. Начните с удаления парафина и гидратации срезов ткани. Используйте промывки ксилолом с последующей серией промывок спиртами разной концентрации.

Затем поместите срезы в 0,2% раствор фосфорной кислоты на пять минут, после чего промойте их водой в течение пяти минут; далее окрасьте срезы 0,1% раствором Sirius Red и пикриновой кислоты в течение двух часов. Затем промойте срезы в 0,01 N растворе соляной кислоты в течение трех минут и сполосните их в 70% этаноле в течение одной минуты. Далее проведите дегидратацию срезов, пропуская их через серию ванн с возрастающей концентрацией спирта в обратном порядке, после чего промойте ксилолом, закройте стекла покровными стеклами и оцените результат с помощью светового микроскопа.

У мышей развилось инвазивное пневмококковое заболевание после заражения штаммом Tiger 4. В желудочках сердца наблюдались микроочаги поражения; при этом в интервале от 24 до 30 часов после инфицирования было отмечено увеличение размера и количества этих очагов. Для подтверждения наличия S. pneumoniae внутри очагов поражения срезы окрашивали на капсульный полисахарид серотипа 4, вырабатываемый штаммом Tiger 4.

Это подтвердило наличие плотно упакованных и компактных агрегатов в местах микроповреждений. Окрашивание срезов сердца мышей, которым вводили ампициллин для спасения, и неинфицированных контрольных животных было выполнено с использованием красителя Piro serious red. В группе спасения.

Наблюдался резкий рост присутствия и интенсивности окрашивания с полосами, исходящими из областей, которые, по всей видимости, были местами прежних поражений в желудочках. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости инфицирования мышей достаточным количеством S pneumonia, чтобы инфекция развивалась в течение как минимум 28–30 часов; это обеспечит достаточное время для формирования бактериемии и микропоражений сердца.