Визуализация Пневмококк В сердечной микроповреждениям и последующих ремоделирования сердца

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать воспроизводимый протокол формирования микропоражения сердца ESMO в сердце инфицированных мышей. Это достигается за счет заражения мышей ESMO и создания условий для развития бактериемии, тем самым предоставляя бактериям доступ к сердечной сосудистой сети, где они могут проникать в миокард и образовывать микроскопические поражения. Затем сердца либо парафинируют, закапывают и окрашивают обычным способом, либо фиксируют в ОКТ-соединение для иммунофлуоресцентного окрашивания.

Оценка окрашенных срезов может показать микропоражения сердца, случайным образом распределенные по отложениям коллагена миокарда и реконвалесцентным участкам сердца и пневмококковым капсулам в микропоражении сердца. Является ли Арманд Браун аспирантом в моей лаборатории? Тем не менее, этот метод может дать представление о разрушительных эффектах сердечной пневмонии во время инвазивной пневмококковой инфекции у мышей.

Его также можно применять к образцам сердца из других систем, таких как приматы или люди. Начнем с выращивания штамма ESMO Serotype four Tiger four в бульоне Todd Hewitt до оптической плотности 0,5 на 620 нанометрах. Когда при правильной плотности гранулы взбейте культуру на 3, 500 г в течение 10 минут.

Затем удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумной линии и повторно суспендируйте бактерии стерильным PBS в дозе 10 000 колониеобразующих единиц на миллилитр. Теперь обезболивают мышей в возрасте от 10 до 12 недель и подтверждают их обезболивающее состояние легким щипком пальца ноги с помощью тупого пинцета, шприца лотоса с бактериальной суспензией и прикрепляют иглу от 27 до 30 калибра. Затем возьмите обезболенную мышь за загривок одной рукой, а другой рукой внутрибрюшинно вводите 100 микролитров суспензии, поместите каждую мышь обратно в клетку.

Мыши обычно просыпаются через 30-40 секунд после инъекции. Получение правильной дозы S. pneumonia имеет решающее значение, иначе мыши могут выздороветь от инфекции или приходят к инвазивной пневмококковой инфекции слишком быстро, чтобы развились поражения. Поскольку каждый штамм бактерий имеет разный уровень хрусталика уха, может потребоваться метод проб и ошибок, чтобы определить правильную дозу.

Дайте инфекции протекать не менее 24 часов до ранней стадии или до 30 часов для поздней стадии инфекции. Позже усыпьте каждую зараженную мышь. Сначала возьмите пробу крови, продезинфицируйте хвост спиртовым тампоном и отрежьте срез в два-три миллиметра.

Соберите два микролитра крови с места ножниц. Серийно разбавляйте кровь в десять раз в ПБС, содержащем гепарин натрия в расчете одна единица на миллилитр. Выложите пять уровней разведений на агаровые пластины триптиха с соевой кровью и инкубируйте их в течение ночи.

На следующий день проводится подсчет колоний. Приступайте к забору сердца, как описано в следующем разделе. В качестве альтернативы, через 30 часов после заражения.

Попытайтесь спасти мышь, введя ампициллин межбрюшинный в 100 микролитрах физиологического раствора. Продолжайте давать ампициллин каждые 12 часов в течение 36 часов и собирайте сердечки в желаемые моменты времени. Во-первых, соберите урожай сердца.

Обездвижите усыпленную мышь в лежачем положении на хирургической платформе, опрыскайте грудную клетку 70% этанолом и промокните насухо. С помощью хирургических ножниц и щипцов откройте грудную полость. Удалите грудную клетку и пересеките диафрагму, чтобы обнажить сердце и легкие.

Затем разрежьте кровеносные сосуды, соединенные с сердцем, и с помощью щипцов аккуратно иссеките сердце без синяков. Промойте сердце PBS и поместите его в кассету для сбора образцов ткани для коронального разреза. Затем переложите кассеты в 10% буферизованный раствор формалина, а на следующий день отправьте на заделку парафина.

На ранних стадиях поражения сердца можно определить по изменению цвета, а в некоторых случаях и по наличию иммунных клеток. При запущенных поражениях иммунные клетки будут отсутствовать и иметь большие размеры. На их месте обнаруживаются поражения, подобные VA.

Используя пятимикронный сердечный срез на положительно заряженных стеклянных предметных стеклах, сначала заморозьте срезы, затем разморозьте их и дайте им высохнуть на воздухе. Зафиксируйте предметные стекла в 10% нейтральном буферизованном формине на 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Затем снимите фиксатор с помощью трех стирок и PBS на пять минут за одну промывку.

Затем пропитайте ткань 0,2% триттона X 100 в PBS в течение 15 минут. Удалите моющее средство еще тремя стирками в прямом PBS. Затем заблокируйте ткань 10%-ной сывороткой в PBS на час после полоскания в PBS, накройте участок антисывороткой на два часа при температуре 37 градусов Цельсия.

Лечите отрицательный контроль наивной антисывороткой кролика Поскольку сердечная ткань легко поглощает иммунофлуоресцентное окрашивание XI, что приводит к высоким фоновым уровням, концентрацию во время инкубации для различных типов антител, вероятно, потребуется оптимизировать. Затем замените раствор вторичным антителом и дайте предметным стеклам инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Теперь нанесите DPI в дозе пять миллиграммов на миллилитр и промойте предметные стекла PBS.

Наконец, установите предметные стекла на пол, сохраните и сфотографируйте их с помощью конфокальной микроскопии. Начните с удаления парафина и увлажнения участков ткани. Используйте промывки ксилолом, за которыми следует поэтапная серия промываний спиртом.

Затем окуните участки в 0,2% фосфосфоменовой кислоты в течение пяти минут, после чего в течение пяти минут промойте следующее пятно 0,1% серьезной красной и рицарской кислотой в течение двух часов. Затем промойте срезы в 0,01 обычной соляной кислоте в течение трех минут и промойте их в 70%-ном этаноле в течение минуты. Теперь обезвожьте срезы, обратив серию градуированных спиртовых ванн, затем промойте ксилолом с помощью светового микроскопического монтирования и оцените предметные стекла.

У мышей развилась инвазивная пневмококковая инфекция после борьбы с тигром. В желудочках наблюдались четыре штаммовых микропоражения сердца, а увеличение размера и количества поражений было отмечено между 24 и 30 часами после заражения, чтобы проверить, действительно ли пневмония находится в пределах поражений. Срезы окрашивали для капсульного полисахарида серотипа 4, полученного Tiger 4.

Это подтвердило наличие плотно упакованных и плотных агрегатов в местах микропоражения. Серьезное окрашивание в красный цвет методом Пиро проводилось на сердечных срезах мышей, которые были спасены ампициллином и неинфицированными контрольными группами. В спасательных операциях.

Наблюдалось резкое увеличение наличия и интенсивности окрашивания с полосами, исходящими из того, что, по-видимому, является бывшими местами поражения в желудочках. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о том, что необходимо заражать мышей с достаточным количеством использования S. pneumonia, чтобы инфекция продолжалась в течение как минимум 28-30 часов, чтобы бактериемия и микропоражения сердца имели достаточно времени для формирования.