Первичная опухоль и MEF Выделение клеток для изучения метастазов в легких

Общая цель данной процедуры — изучение агенеза опухолей при раке молочной железы у мышей. Сначала демонстрируется процесс подготовки первичных клеток из опухолей молочной железы мыши. Затем представлен способ извлечения легкого мыши для визуализации метастазов в легких.

Наконец, в заключении представлен способ получения эмбриональных фибробластов мыши из эмбрионов мыши; данные методы демонстрируют, что трансгенные мыши по полиома-среднему Т-антигену вируса опухолей молочных желез мыши могут быть использованы для исследования онкогенеза рака молочной железы. Хотя данный метод позволяет получить представление о раке молочной железы, он также может быть применен для исследования других солидных опухолей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как на этапах выделения опухоли важно изолировать только опухолевую ткань, исключив другие ткани. Начните с того, что с помощью ножниц вскройте кожу от уретрального отверстия до шеи трансгенной мыши по полиома-среднему Т-антигену вируса опухолей молочных желез мыши.

Затем зафиксируйте кожу булавками и выделите опухоль молочной железы. Промойте опухоль in situ холодным PBS и поместите ее в стерильную чашку для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров. Далее перенесите чашку в стерильный ламинарный бокс и с помощью стерильного лезвия бритвы и ножниц измельчите опухоль на кусочки размером один кубический миллиметр.

Инкубируйте фрагменты с коллагеназой на шейкере при 37 °C. Через два часа центрифугируйте полученную суспензию опухолевой ткани. Промойте осадок еще три раза в PBS Resus, после последнего промывания пересуспендируйте осадок в двух миллилитрах трипсина-ЭДТА и выдержите в течение пяти минут при 37 °C с перемешиванием.

Затем промойте клетки еще три раза и ресуспендируйте их в нормальной ростовой среде. В завершение инкубируйте клетки в чашке для культивирования тканей диаметром 10 сантиметров, ежедневно заменяя среду в течение следующих трех дней до достижения необходимого количества клеток. Перед извлечением легкого удалите печень и диафрагму и отодвиньте ребра.

Затем вскройте верхнюю часть трахеи рядом с яремной веной и с помощью катетера введите соответствующий агент через трахею для заполнения легких, извлеките легкие, а затем, если используется фиксатор Z, залейте ткань парафином. Если используются чернила из Индии, выдержите ткань в растворе inec в течение пяти минут: нормальная ткань легких окрасится в черный цвет, в то время как опухолевые узлы будут выглядеть белыми. Классифицируйте любые опухолевые узлы, визуализированные в вторичных очагах с диаметром ≥ 0,5 мм, как метастазы для получения эмбриональных фибробластов мыши.

Сначала вскройте кожу беременной мыши от уретрального отверстия до шеи, как было продемонстрировано, стараясь не повредить эмбрионы. Затем извлеките рога матки и промойте их стерильным PBS. После этого аккуратно отделите эмбрионы от плаценты по одному.

Поместите каждый эмбрион в чашку Петри диаметром 10 сантиметров с ледяным PBS. После удаления головы, печени и кишечника промойте оставшуюся часть эмбриона в лунке 12-луночного планшета для культивирования тканей с PBS, затем разрежьте тело на фрагменты размером один кубический миллиметр. Перенесите ткань в другую лунку, содержащую пять миллилитров трипсин-EDTA, и инкубируйте при температуре 37 °C.

Через пять минут добавьте 1 мл FBS, чтобы инактивировать процесс переваривания. Затем центрифугируйте полученную клеточную суспензию и ресуспендируйте осадок. В 1 мл теплого DMEM перенесите клетки в 10-сантиметровую чашку для культивирования, содержащую 10 мл DMEM с добавлением антибиотиков, и культивируйте клетки до достижения необходимого их количества.

Стадия прогрессирования опухоли, при которой производится жертвование животного, зависит от конкретного исследования и руководящих принципов I-A-C-U-C. Например, эта 100-дневная мышь линии FVB с антигеном среднего T полиомавируса опухолей молочной железы мыши была подвергнута эвтаназии через три месяца после того, как была выделена опухоль молочной железы мыши, как было продемонстрировано. Были получены первичные опухолевые клетки.

Поскольку многие гены опосредуют метастазирование рака молочной железы в легкие, для изучения процесса метастазирования были извлечены также и легкие, как было продемонстрировано ранее. Затем легкие раздували с помощью фиксатора Z fix и окрашивали индийскими чернилами для визуализации опухолевых узлов. Здесь представлены эмбриональные фибробласты мыши, выделенные из эмбрионов мышей линии FVB.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как изолировать первичные опухолевые клетки мыши и эмбриональные фибробласты мыши, а также как извлечь легкое мыши. Не забывайте, что работа с изофлураном может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу.