Улучшенная Генетический анализ одного человека Bioparticles извлечены с помощью упрощенной Микроманипуляция от судебно-медицинской экспертизы на ощупь ДНК »

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы извлечь отдельные или агломерированные клетки, называемые предполагаемыми биочастицами, из судебно-медицинских доказательств ДНК и получить профиль ДНК донора. Во время совершения насильственного преступления небольшое количество клеток передается от одного человека к другому, например, когда нападающий хватает жертву за запястье. Чтобы сначала восстановить небольшое количество клеток, используйте гелевую пленку с низкой адгезией, прикрепленную к предметному стеклу микроскопа, для отбора образцов контактной области.

Второй шаг – окрашивание перенесенных биочастиц для более удобного просмотра под микроскопом. Далее изолируйте биочастицы от гелевой пленки с помощью микроманипуляций. Соберите водорастворимый клей на кончике вольфрамовой иглы и с его помощью удалите интересующие биочастицы с поверхности гелевой пленки.

Заключительным этапом является тщательный перенос индивидуально собранных биочастиц в смесь для амплификации ПЦР на дне коллекции ПЦР, чтобы в конечном итоге использовать усовершенствованные методы типирования ДНК для получения профиля ДНК донора следовых доказательств ДНК. Хорошо, в моей лаборатории мы сосредоточились на генетическом анализе небольшого количества клеток, которые передаются во время совершения насильственного преступления против человека между одним человеком и другим человеком, или между человеком и объектом. Традиционными методами часто не удается восстановить профиль ДНК из такого небольшого числа клеток.

Здесь мы разработали упрощенный метод физического восстановления и генетического анализа такого небольшого числа клеток, как отдельных клеток, так и агломератов клеток, которые могут быть включены в любую лабораторию судебной экспертизы. Демонстрировать процедуру будет Кэти Фэйриш, аспирантка моей лаборатории. Для начала этой процедуры подготовьте гелевую пленку, которая будет использоваться для сбора биочастиц.

Разрежьте гелевую пленку до нужного размера, подходящего для предметного стекла микроскопа, используемого в качестве твердой основы. Например, для предметного стекла размером три дюйма на один дюйм используйте гелевую пленку размером два дюйма на 0,75 дюйма. Снимите белую подложку с гелевой пленки и прикрепите гелевую пленку к предметному стеклу микроскопа, плотно прижав вниз, чтобы обеспечить полное крепление.

Обратите внимание, что существует прозрачный верхний защитный слой, который не следует снимать, чтобы позволить приложить давление вдоль куска гелевой пленки без загрязнения поверхности гелевой пленки, подготовленные гелевые пленки с прикрепленным защитным слоем можно хранить при комнатной температуре до тех пор, пока это не понадобится. Когда гелевая пленка будет готова к использованию, используйте стерильный пинцет для снятия прозрачного верхнего защитного слоя. Поместите поверхность гелевой пленки в непосредственный контакт с желаемым объектом или поверхностью, к которой вы прикасаетесь.

Например, человеческая кожа с запястья. Приложите небольшое давление, чтобы обеспечить эффективный перенос биочастиц на гелевую пленку. Не нажимайте слишком сильно, так как предметное стекло может сломаться Несколько образцов с одного и того же объекта или поверхности могут быть собраны на одном и том же куске гелевой пленки Таким же образом биочастицы могут быть собраны с предметов и предметов одежды, таких как воротник рубашки.

Чтобы подтвердить перенос биочастиц на гелевую пленку, рассмотрите предметное стекло на стереомикроскопе с помощью транс- или эпи-подсветки. Увеличение примерно в 20 раз лучше всего подходит для просмотра больших площадей гелевой пленки, в то время как увеличение примерно в 200 раз лучше всего подходит для просмотра отдельных биочастиц. Храните образец предметного стекла из гелевой пленки при комнатной температуре в закрытой предметной коробке.

До тех пор, пока они не будут готовы к окрашиванию и/или сбору биочастиц, биочастицы могут быть окрашены для облегчения визуализации. Для выполнения этого первого задания образец гелевой пленки подготавливают, как показано ранее, на решетку для окрашивания предметных стекол над раковиной. С помощью одноразовой переводной пипетки покрыть всю поверхность гелевой пленки морилкой триан синий, инкубировать при комнатной температуре в течение одной-двух минут.

Удалите излишки пятна, наклонив слайд, чтобы пятно при необходимости стекло в раковину. Предметное стекло можно промыть, аккуратно залив стерильной водой с помощью одноразовой переводной пипетки. После того, как предметное стекло высохнет, рассмотрите предметное стекло с помощью стереомикроскопа, чтобы убедиться в правильном окрашивании.

Испачканное предметное стекло можно хранить при комнатной температуре в закрытом ящике для предметных стекол. Начните эту процедуру с помещения соответствующего количества 0,2 миллилитровых ПЦР-пробирок в штатив и соответствующей маркировки пробирок. Приготовьте подходящий объем смеси для амплификации STR для желаемого количества образцов.

Вортекс и мастер хорошо перемешать и кратковременно центрифугировать в мини-центрифуге PI тракт. 3,5 мкл амплификации. Смешайте в каждой пробирке объемом 0,2 миллилитра крышку каждого тюбика свободно.

Поместите кусок двустороннего липкого скотча прямо на стеклянный блок. Это будет использоваться для удержания пробирки объемом 0,2 миллилитра на месте во время сбора пробы. Поместите еще один кусок двустороннего липкого скотча на предметное стекло микроскопа.

Затем поместите кусок водорастворимой волнообразной плечевой ленты поверх двусторонней липкой ленты. Закрепите ленту на месте, надавливая на нее по всей длине ленты. После этого защитный верхний белый слой можно снять.

Далее поместите первую 0,2 миллилитровую трубку на двустороннюю липкую ленту на стеклоблок. Отложите эту пробирку в сторону до тех пор, пока образец не будет собран. Поместите водорастворимую волновую ленту солдатика под микроскоп во время просмотра при малом увеличении.

Используйте кончик иглы-подставки для язычков, чтобы аккуратно соскоблить поверхность ленты, чтобы собрать небольшое количество или шарик клея на конце иглы. Размер шарика клея будет зависеть от количества биочастиц, которые необходимо тщательно собрать. Удалите язычки.

Подставьте иглу с клеем из-под микроскопа, не потревожив кончик иглы. При необходимости поместите иглу в штатибу. Наиболее важным аспектом процедуры является сбор и перенос биочастиц

Чтобы обеспечить успех, техники необходимо практиковать до тех пор, пока аналитик не освоит их. Поместите заранее подготовленный образец гелевой пленки на предметный столик микроскопа, используя стеклянный блок для поддержки предметного стекла. Отрегулируйте фокус и увеличение до тех пор, пока биочастицы не станут легко различимы.

Определите биочастицы, которые будут собираться. Извлеките вольфрамовую иглу с помощью клеевого шарика и поместите иглу на поверхность гелевой пленки, где находятся интересующие биочастицы. Надавите на кончик иглы так, чтобы он соприкасался с биочастицей.

Поднимите иглу вверх, чтобы убедиться, что биочастица была собрана. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет собрано нужное количество биочастиц. Поместите подготовленную ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра на предметный столик микроскопа.

Отрегулируйте увеличение так, чтобы нижняя часть трубки, содержащей усилительную смесь, оказалась в фокусе. Рассматривая в микроскоп, осторожно введите вольфрамовую иглу в ПЦР-пробирку объемом 0,2 миллилитра до тех пор, пока кончик иглы не окажется в амплификационной смеси. Удерживайте иглу в амплификационной смеси до тех пор, пока клей не растворится и не будет наблюдаться выброс биочастиц в раствор.

Извлеките иглу. Поставьте тюбик объемом 0,2 миллилитра вертикально и неплотно закройте его крышкой. Очистите вольфрамовую иглу предварительно смоченной спиртовой салфеткой и повторите эту процедуру сбора для дополнительных образцов.

Чтобы начать протокол усиленной амплификации для аутосомного STR-профилирования собранных биочастиц, добавьте 1,5 микролитра буфера для лизиса в каждую 0,2-миллилитровую пробирку, содержащую смесь для амплификации, и биочастицы плотно закройте крышки пробирок. Поместите образцы в термоамплификатор и амплифицируйте образцы с использованием условий циклирования, описанных в тексте протокола После завершения амплификации. Храните продукты усиления при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к обнаружению с помощью капиллярного электрофореза.

Репрезентативные изображения отдельных биочастиц в образце воротника рубашки не показаны. Собранные биочастицы обведены кружком. Красные круги указывают на то, что профиль был восстановлен.

Процент восстановления аллеля включен. Черные круги указывают на то, что профиль не был восстановлен. Аналогичным образом, эти изображения представляют собой слипшиеся биочастицы в образце воротника рубашки, показанный здесь, представляет собой профиль STR, полученный из одного из отдельных образцов биочастиц с воротника рубашки.

Его точность определялась путем сравнения с эталонным профилем. Номера аллелей обозначаются ниже каждого пика в каждом локусе. Ось x представляет размер фрагмента, а ось Y — интенсивность сигнала.

Этот профиль отличается высоким качеством с достаточно сбалансированными высотами межлокусных пиков и отсутствием аллельного выпадения. Следующий профиль представляет собой полный профиль STR, полученный из одного из слипшихся образцов биочастиц с воротника рубашки. Наконец, на этом рисунке показан пример неудачного профилирования ДНК одной биочастицы с 3%-ным восстановлением аллеля.

Этот метод должен способствовать восстановлению профилей ДНК из одного источника у нападавших в случаях физического насилия. От нашего внимания не ускользнул тот факт, что этот метод также устраняет некоторые проблемы, связанные с интерпретацией и деконволюцией смешанных профилей ДНК.