Засохшей крови пятна - подготовка и обработки для использования в Immunoassays и молекулярных методов

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить стандартизированный протокол подготовки и обработки сухих пятен крови, который впоследствии будет использоваться в иммунологических анализах и молекулярных методах. Это достигается путем взятия сначала капиллярной крови и переноса ее на фильтр-карту. Второй шаг – высушить пятна крови на ночь и получить шесть миллиметровых проколов из кругов фильтрующей карты.

Далее яне засохшей крови от ударов достигается путем погружения в буфер на шейкер минимум на четыре часа. Затем гемолитические ЭИТ освобождаются от мусора путем центрифугирования. Заключительным этапом является анализ очищенных ЭИТ на серологические и молекулярные маркеры инфекций вирусами гепатита В, гепатита С и иммунодефицита человека с помощью коммерчески доступных иммунологических анализов и молекулярных методов.

Идея использования сюжета, собранного на фильтр-карте, изготовленной из клеточной клетки, возникла столетие назад. Тем не менее, люди, впервые использующие этот метод, часто сталкиваются с трудностями даже сегодня, потому что вся преаналитическая фаза, которая включает в себя подготовку и обработку сухих пятен крови для их окончательного анализа, не была стандартизирована почти для всех применений исследования сухих пятен крови. Учитывая эти обстоятельства, мы предлагаем комплексный стандартизированный пошаговый протокол подготовки и обработки сухих пятен крови, который впоследствии будет использоваться в иммунном анализе и молекулярных методах.

Визуальная демонстрация этой методики представляется решающей, так как несколько этапов похожи на удаление капиллярной крови. Это верно. Перенос на карты фильтров или подготовка соответствующих ударов из толпы не так просты в освоении, и, следовательно, люди, которые используют эту технику впервые, несомненно, выиграют от визуального представления.

Капиллярная кровь будет взята из пальца Нико техником из нашей лаборатории, чтобы продемонстрировать процедуру обработки. Полученные пятна крови будет проводить техник ко, который уже много лет работает в нашей лаборатории по молекулярно-биологической диагностике для пункции кожи. Для начала наденьте пару одноразовых латексных резиновых перчаток.

Перед пункцией кожи пациент должен согреть руки. Палец сильно массируется, чтобы обогатить приток крови к месту верхнего прокола. Затем очистите кожу со стороны Палмера, дистальную фалангу третьего или четвертого пальца непишущей руки подходящим дезинфицирующим средством, проколите кожу одноразовым безопасным ланцетом.

Пальцы рук следует держать в таком положении, чтобы сила тяжести способствовала сбору крови на кончике пальца. Вытрите первую каплю крови марлевой салфеткой, поскольку в ней могут содержаться излишки тканевой жидкости. После повторного массирования пальца для усиления кровотока в месте прокола перенесите следующую каплю на один из кругов фильтрующей карты, не касаясь поверхности непосредственно подушечкой пальца.

Дайте следующей большой капиллярной крови образоваться на кончике пальца и соберите ее в следующий круг. Продолжайте эту процедуру до тех пор, пока не будут заполнены все необходимые круги или не прекратится кровоток во время сбора. Дайте крови впитаться в текстуру фильтра только под действием капиллярных сил.

Не сжимайте и не доите палец чрезмерно, если кровоток недостаточен для заполнения всех необходимых кругов фильтрующей карты. Если кровоток остановился, наложите повязку на кончик пальца, выполните повторный прокол кожи на другом пальце, если для обследования требуется больше крови, чтобы высушить пятна крови, положите фильтрующие карты на чистое бумажное полотенце в шкаф биологически опасной безопасности и дайте им высохнуть, желательно в течение ночи при комнатной температуре. При отсутствии какого-либо внешнего источника тепла, когда процесс сушки завершен, кровяные пятна имеют равномерно темно-коричневатый цвет, и больше не видно красных участков для хранения.

Поместите карту фильтровальной бумаги в один газонепроницаемый пакет на молнии, содержащий один-два пакетика с влагопоглотителем для защиты образцов от влаги. Как можно скорее перенесите этот пакет в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов по Цельсию или ниже. Если морозильные камеры недоступны в полевых условиях, хранение при температуре минус четыре градуса Цельсия или даже при температуре окружающей среды возможно до 14 дней.

Выбейте одно пятно с помощью одноразового шестимиллиметрового устройства из каждого пропитанного кровью круга передачи фильтр-карты класса 9 0 3, все высушенные пятна крови от одного пациента в одну лунку из 12. Луночный планшет заполните лунку фосфатным буферным солевым раствором, содержащим 0,05% твин 20 и 0,08% азида натрия. Повторите эти шаги, чтобы получить вторую серию ЭИТ сухих пятен крови для проведения молекулярного анализа.

Затем поместите планшет для культивирования клеток на лабораторный шейкер и дайте пуншуну осторожно вымыть высушенные пятна крови в течение как минимум четырех часов или, желательно, на ночь. На следующий день пятна почти свободны от крови и образовались гемолитические надосадочные жидкости. Перенесите эти ЭИТ в микроцентрифужные пробирки, затем подвергните их центрифугированию в течение двух минут при температуре 10, 500 раз больше G, чтобы освободить вас.

Надосадочная жидкость из любого мусора, образовавшегося во время центрифугированной ЭИТ по Эллуциану, теперь готова к использованию для предполагаемых анализов. Первая серия ЭИТ перекладывается в чашки для серологического тестирования. Вторая серия переносится в микропробирки для ПЦР-анализа.

Исследуйте ЭИТ на маркеры вируса гепатита В, вируса гепатита С и ВИЧ-инфекции с использованием имеющихся в продаже анализов и тщательно следуйте инструкциям производителя. Наконец, результаты серологического тестирования на полностью автоматическом анализаторе отображаются на экране системы. Эффективность предложенного протокола для подготовки и обработки сухих пятен крови была впервые оценена путем анализа 1 762 сопряженных пар сухих пятен крови в сыворотке крови в отношении определения поверхностного антигена вируса гепатита В.

Протокол анализа был модифицирован, поскольку при пороговом значении 0,05 международных единиц на миллилитр 56,2% ЭИТ были реактивными по сравнению с результатами, полученными от Сары. Это соответствовало уровню ложноположительных результатов в 14,7% при тестировании на поверхностный антиген вируса гепатита В. Анализ рабочих характеристик приемника показал, что увеличение порога до 0,15 международных единиц на миллилитр приведет к идеальному отделению положительных поверхностных антигенов вируса гепатита В от отрицательных поверхностных антигенов вируса гепатита В при исследовании пар сухих пятен крови сыворотки крови на наличие поверхностного антигена вируса гепатита В. Было получено только два несоответствия.

Две ложноотрицательные Сары были получены от пациентов, проходящих противовирусную терапию. Качественное определение H-B-V-D-N-A методом ПЦР в реальном времени из ЭИТ цельной крови показало чувствительность 93%. Таким образом, семь образцов с низкими концентрациями H-B-V-D-N-A в сыворотке крови не были обнаружены. Только четыре ложноотрицательных результата на анти-HCV были определены по высушенным пятнам крови EIT.

Весьма вероятно, что соответствующие С были взяты у пациентов, чьи инфекции уже давно разрешились. Аналитическая чувствительность 100% для определения H-C-V-R-N-A из высушенных пятен крови EIT указывает на превосходную чувствительность подхода к амплификации, опосредованной изотермической транскрипцией, который использовался для амплификации H-C-V-R-N-A. Обнаружение антител к ВИЧ в ЭИТ сухих пятен крови с помощью полностью автоматизированной системы также привело к аналитической чувствительности 100%Это видео показывает, что в настоящее время стало возможным надежно обнаруживать серологические и молекулярные маркеры инфекций гепатита В, гепатита С и ВИЧ во всех узких пятнах крови, даже при использовании сравнительно большого объема элюирования и модификации протоколов эссе, установленных для исследований сыворотки или плазмы, существенно не изменился.

Тем не менее, представленные результаты также подтвердили внутренние ограничения техники высушенных пятен крови. В некоторых случаях. Изложенный протокол также был протестирован в полевых условиях на 534 активных потребителях наркотиков в немецких городах Берлин и Эссен во время пилотной фазы исследования лекарств и хронических инфекционных заболеваний.

Полученные результаты привели к незначительной модификации алгоритма тестирования для основной фазы исследования препарата еще в шести крупных городах Германии.