Синхронизация Caulobacter Crescentus По расследованию бактериального клеточного цикла

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать клетки Coob backer swarmer для создания синхронизированной клеточной культуры. Это достигается путем сначала выращивания смешанной культуры клеток подложки кобса, а затем кратковременной остановки роста путем суспензии клеток Resus в холодной среде. Вторым шагом является разделение роевых ячеек с помощью центрифугирования с дифференциальной плотностью.

Следующим шагом является ресуспендирование роевых клеток в теплой среде, что позволяет клеткам вступить в клеточный цикл. Наконец, за изолированными клетками роя можно наблюдать на протяжении всего клеточного цикла с помощью биохимических анализов или микроскопии. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами, такими как машина для производства детских клеток, заключается в том, что клетки могут быть быстро выделены и увеличены в количестве, достаточном для биохимических исследований.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, например, что контролирует сегрегацию хромосом и асимметричный цикл деления клеток. Для начала завите пять миллилитров среды PYE бактериями из пластины colo backer штамма CSIS, NA 1000. Выращивайте культуру в течение ночи при температуре 28 градусов Цельсия с встряхиванием на следующий день, переложите 0,5 миллилитров ночной культуры в колбу, содержащую 25 миллилитров среды M two G, и встряхивайте колбу при температуре 28 градусов Цельсия до тех пор, пока культура не достигнет оптической плотности от 0,5 до 0,6.

Далее разведите культуру в одном литре среды М 2 G для получения желаемой начальной оптической плотности и встряхните колбу при температуре 28 градусов Цельсия, когда оптическая плотность культуры достигнет 0,5 пипетки, нанесите один микролитр культуры на предметное стекло, а затем накройте жидкость покровным стеклом. Визуализируйте клетки с помощью фазовой микроскопии, чтобы подтвердить наличие быстро плавающих роевых клеток. Перенесите культуру в стерильную центрифужную пробирку, а затем вращайте клетки при температуре 7000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Далее отбраковывайте неплотно гранулированные ячейки при сливе надосадочной жидкости и добавляйте 180 миллилитров холодного М двух средних. Используйте серологическую пипетку, чтобы мягко ресуспендировать клетки. Затем добавьте в клеточную суспензию 60 миллилитров холодного раствора коллоидного диоксида кремния и хорошо перемешайте.

Разлейте клеточную суспензию в восемь пробирок объемом 30 миллилитров и центрифугируйте их при 6, 400 умноженных на G в течение 30 минут. Установите четыре градуса по Цельсию. Аккуратно извлеките пробирки из центрифуги и проверьте пробирку на наличие двух отдельных полос.

Нижняя полоса содержит роевые клетки, а пределочные ячейки находятся в верхней полосе. Затем осторожно отсасывайте верхнюю ленту и жидкость примерно на один сантиметр выше нижней полосы. С помощью пастерной пипетки снимите роевую ленту и переложите ее в чистую пробирку.

Заполните пробирку холодной средой М два, а затем центрифугируйте пробирку, чтобы смыть коллоидный диоксид кремния. Далее аккуратно откажитесь от надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в 20 миллилитрах холодной М двух средних центрифуг. Снова оденьте клетки, повторно суспендируйте гранулы в 30 миллилитрах холодной М двух сред, а затем измерьте оптическую плотность суспензии.

Поместите один микролитр клеточной суспензии на предметное стекло микроскопа и с помощью фазовой визуализации проверьте наличие роевых клеток. Затем центрифугируют клетки и ресуспендируют их в среде М2G до оптической плотности от 0,3 до 0,4. Инкубируйте культуру при встряхивании при температуре 28 градусов Цельсия для вестернстрима или анализа экспрессии генов.

Удаляйте по одному миллилитру аликвот каждые 10–30 минут в течение примерно 140 минут, пока оптическая плотность культуры не удвоится. Используйте настольную центрифугу для замедления ячеек в течение 30 секунд, а затем быстро вдохните среднюю вспышку. Заморозьте гранулы клеток в жидком азоте и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия для синхронного использования в малых масштабах, инокулируйте пять миллилитров среды M two G клетками NA 1000 и выращивайте клетки в течение ночи с встряхиванием при температуре 28 градусов Цельсия на следующий день.

Разведите культуру в 15 миллилитрах среды М2G и выращивайте клетки до тех пор, пока оптическая плотность не составит от 0,5 до 0,6. Центрифугируйте клетки, а затем повторно суспендируйте их в одном миллилитре холодной М-2 среды. Переложите клетки в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку, гранулируйте клетки центрифугированием и аспирируйте натнат.

Затем поместите трубку на лед и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 900 микролитрах холодной М двух сред. Далее добавьте 900 микролитров коллоидного диоксида кремния, покрытого холодным PVP, и центрифугируйте пробирку в течение 20 минут. Осторожно отсадите верхнюю полосу перед делением клеток, а затем соберите нижнюю полосу роя в новую микроцентрифужную пробирку.

Промойте ячейки роя два раза в одном миллилитре холодной среды M two во время центрифугирования в течение трех минут между каждой промывкой прямо перед окончательным отжимом. Поместите клеточную суспензию в предварительно охлажденную стеклянную пробирку объемом один миллилитр и измерьте оптическую плотность клеток. Затем перенесите клетки в микропробирку и центрифугу после центрирования.

Риз, суспензируйте последнюю клеточную гранулу в предварительно разогретой среде М 2 G при оптической плотности от 0,3 до 0,4 и встряхните клетки при температуре 28 градусов Цельсия. Если требуется микроскопия, поместите один микролитр культуры на аэродинамическую площадку M 2G в соответствующие моменты времени. Центрифугирование асинхронной культуры с дифференциальной плотностью дает две полосы клеток.

Нижняя полоса содержит роевые клетки, которые имеют более высокую плотность, а верхняя полоса содержит запасные и предделительные клетки, которые имеют меньшую плотность. Оптическая плотность культуры увеличивается примерно в два раза в течение клеточного цикла. В течение этого времени роевые клетки дифференцируются в сток-клетки, которые затем реплицируются и подвергаются асимметричному делению.

С каждым делением, в результате которого образуется новая клетка роя и родительская стоковая клетка, вестерн-блот для главного регулятора клеточного цикла CTRA является полезным контролем для проверки синхронизации, CTRA блокирует репликацию ДНК в клетках роя и разрушается при репликации ДНК. Затем CTRA синтезируется на более поздних этапах клеточного цикла, предотвращая повторную репликацию ДНК и активируя транскрипцию многих генов развития. Этот колеблющийся паттерн уровней белка CTRA указывает на успешную синхронность.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как синхронизировать обратный вызов или NA 1000 клеток для исследования бактериального клеточного цикла. Эта процедура синхронизации ячеек может быть выполнена за один-два часа при правильном выполнении. Во время выполнения этой процедуры важно помнить о работе быстро.