Протоколы Получение зиготических и соматических эмбрионов для изучения Положение раннего развития эмбрионов в Типовом бобовых Medicago truncatula

Общая цель следующих процедур состоит в том, чтобы продемонстрировать, сколько эмбрионов груза тула может быть получено на разных стадиях развития Чтобы исследовать генетическую регуляцию эмбриогенеза у растений, это может быть достигнуто путем связывания морфологии стручка с различными стадиями развития зиготического эмбриона, а также путем культивирования листьев для получения соматических эмбрионов на различных стадиях. В конечном счете, количественная ПЦР и бета-глюкуронидаза могут быть использованы для оценки экспрессии генов во время эмбриогенеза на конкретных стадиях развития, представляющих интерес. Преимущества этих методик заключаются в том, что для экспериментов in vivo не требуется маркировка отдельных цветков, а оптимизируются процедуры in vitro, обеспечивающие взаимодополняющие экспериментальные подходы.

Визуальная демонстрация процедуры культивирования важна, поскольку позволяет более внимательно следить за деталями манипуляций. Демонстрировать процедуру in vivo будет Инг Ван, а Ким Нолан – процедуру in vitro. Чтобы облегчить развитие зиготического эмбриона, прокалывайте поверхность семенных оболочек семян тринокулярного растения Монте-карго и замачивайте семена на ночь, полностью покрытые водой.

На следующий день посейте по три семечка в каждый из 10 горшков диаметром 15 сантиметров в почвенную смесь и перенесите горшки в стеклянный дом. Выращивайте растения в течение 14-часового периода фотосъемки при дневной температуре от 23 до 19 градусов по Цельсию, сохраняя самые здоровые саженцы после прорастания, чтобы в горшке было одно растение, и окружая рассаду шпалерами, чтобы стебли растений могли взбираться по ним, когда появятся стручки. Соберите на соответствующих стадиях, описанных в таблице 1 и на рисунке 1, чтобы получить желаемую раннюю стадию развития эмбриона.

Затем с помощью щипцов изолируйте лес от стручков. В качестве альтернативы, для более точной микроскопии, полностью прозрачной в растворе Хойера, стадии эмбриона могут быть подтверждены путем визуализации эмбрионов под стандартным составным микроскопом. Затем соберите необходимое для эксперимента количество UL из центральной области капсулы и сохраните их при соответствующей температуре для последующего анализа на предмет развития соматического эмбриона.

Листочки in vitro собирают из последнего, почти полностью раскрывшегося соскового листа удлиненного стебля сорта tran atula, который способен легко образовывать зародыши в культуре. Храните листья тата на влажном бумажном полотенце в горшке для культуры, чтобы избежать обезвоживания. Затем, работая в стерилизованном УФ-шкафом биобезопасности, поместил листья в сетчатый шар автоклавного заварочного устройства для весеннего чая.

Погруженный заварочный узел в 70% этанол в автоклав с завинчивающейся крышкой объемом 250 миллилитров. В горшке с поликарбонатом через 30 секунд слейте ткань листа, а затем погрузите заварочный узел в разбавленный раствор отбеливателя в соотношении от одного до восьми на 10 минут. Время от времени осторожно поворачивая горшок, аккуратно поворачивайте горшок и сливайте лишнюю воду.

Затем промойте заварочный узел. Еще раз в пресную деионизированную воду в новой кастрюле. Теперь с помощью стерильных щипцов переложите листья из заварки чая в свежую культуру, кастрюлю со стерильной деионизированной дистиллированной водой закрутите на стерильную крышку.

Затем промойте листья методом инверсии и закручивания. Затем дайте створкам поплавать на стерильной воде, чтобы наложить имплантаты. Обрежьте края отдельных стерилизованных листочков стерильной техникой.

Затем разрежьте оставшийся прямоугольник на два или три, от восьми до 10 на три-пять миллиметров прямоугольного контура со средней жилкой в центре каждой пластины X-образного контура. Шесть эксплантов на один агар затвердевали питательной средой диаметром девять сантиметров. Чашки Петри уплотнительной стороной ABA вниз для сохранения обычной ориентации листьев.

Затем укупорьте чашки Петри перфилом и инкубируйте тарелки в темноте при температуре 28 градусов Цельсия в помещении с контролируемой температурой. Через три недели используйте стерильный шпатель из нержавеющей стали и щипцы для субкультивирования дифференцирующих отверстий эксплантов на свежую среду. Первые эмбрионы должны наблюдаться примерно через четыре недели, так как происходит мозоли, и каллус превышает размер самой большой формы, показанной здесь.

Переносите только 50% отдельной каллуса при субкультуре в свежую среду. Наконец, используйте стереомикроскоп для сбора различных стадий эмбриона в течение инкубационного периода от четырех до восьми недель, обрабатывая экспланты в соответствии с экспериментальными целями. После сбора зиготических эмбрионов, как это только что было продемонстрировано ниже по потоку в C, можно использовать две гибридизации или другие подходящие стратегии, представляющие особый интерес, как показано на этих изображениях, можно наблюдать различительную способность SSIS и Spencer, следуя планам X.

В течение 4-8 недель соматические эмбрионы на определенных стадиях могут быть обнаружены и отобраны для немедленного анализа. Например, эти данные иллюстрируют, как эмбрионы на ранней стадии Олеина демонстрируют экспрессию одного типа гена Medicago Tula eoin, но не демонстрируют другой. Особым преимуществом системы соматического эмбриона является то, что трансформация каллуса может быть проведена без регенерации всего растения.

Действительно, как показано здесь. Бета-глюкуронидаза может быть использована для визуализации экспрессии генов на разных этапах эмбриогенеза. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выбрать и диссекторировать под, чтобы получить Андреса.

Также следует хорошо понимать, как готовить и проводить стерильные экспозиции для соматического эмбриогенеза после их развития. Эти методы позволили исследовать регуляцию транскрипции на ранних стадиях эмбриогенеза в связи с ростом эмбрионов, развитием и хранением питательных веществ.