Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Общая цель этой процедуры — измерить чувствительность мышей к холоду. Это достигается путем предварительного охлаждения или нагрева стекла до нужной температуры. Второй шаг – акклиматизация мышей до тех пор, пока они не перейдут в состояние покоя.

Третий шаг – сжатие порошка сухого льда в гранулу в шприце. Последним шагом является тестирование мышей с использованием гранул сухого льда и секундомера для измерения задержки вывода. В конечном счете, анализ холодной сеялки используется для измерения чувствительности к холоду и адаптации у свободно ведущих себя мышей.

Основное преимущество нашего анализа по сравнению с существующими в настоящее время тестами, такими как ацетоновый тест и холодный тест, заключается в том, что мы можем тестировать как гиперчувствительность, так и анальгезию на исходном уровне в различных условиях окружающей среды. Хотя этот метод может дать представление о чувствительности мышей к холоду. Он также может быть использован в других системах, таких как обезьяна, крыса и человек. Продемонстрирует эту процедуру Даниэль Бреннер, аспирант моей лаборатории.

После очистки стеклянной поверхности закрепите щуп термопары типа Т на поверхности в середине стеклянной пластины с помощью лабораторной ленты. Разместите вольеры для животных на стеклянной пластине в одну линию посередине. Затем проденьте щуп термопары через центральный вольер для животных и подключите его к регистратору данных.

Включите регистратор данных и отключите функцию автоматического выключения. Подключите регистратор данных к компьютеру с помощью прилагаемого кабеля. Разделите вольеры для животных черными вставками, чтобы предотвратить визуальное взаимодействие между мышами, и расположите зеркала под стеклом, чтобы можно было видеть нижнюю часть вольеров.

Чтобы начать испытания, поместите алюминиевые коробки на стеклянную пластину по обе стороны от животного, вольеры на фиксированном расстоянии. При тестировании при температуре 30 градусов Цельсия подключите циркуляционные насосы с подогревом к алюминиевым коробкам, расположенным на расстоянии 0,25 дюйма от вольера для животных. Наполните ящики водой наполовину, пока дренажные отверстия закупориваются.

Расположите термостаты таким образом, чтобы горячая вода из алюминиевых коробок стекала непосредственно обратно в резервуар термостата с каждой стороны. Вам нужно будет добавить воду в каждый циркуляционный насос. Как только металлические коробки будут заполнены, установите циркуляционные насосы на 45-60 градусов Цельсия и наполните алюминиевые коробки постоянным потоком горячей воды.

Когда стекла достигнут нужного температурного диапазона, поместите мышей в вольеры на тарелку. Дайте мышам акклиматизироваться к аппарату и температуре. Эти мыши акклиматизируются в течение 2,5 часов.

Когда период акклиматизации приближается к концу, наполните ведро со льдом примерно наполовину сухим льдом и с помощью молотка или молотка измельчите сухой лед в порошок. Делайте это за пределами поведенческой комнаты, чтобы не беспокоить мышей. Далее с помощью лезвия бритвы или ножниц отрежьте верхнюю часть от трехмиллилитрового шприца.

Затем с помощью иглы 21 калибра проделайте два набора по три отверстия на противоположных сторонах шприца, чтобы уменьшить давление, создаваемое сублимацией, сжимая сухой лед обратно в поведенческую комнату, заполните камеру шприца наполовину порошком сухого льда. Прижмите отрезанный конец шприца к плоскому предмету и плотно сожмите порошок с помощью поршня. Вытяните кончик палетки для сжатого сухого льда за край шприца.

Теперь испытайте тех мышей, которые держат все четыре лапы в стекле и не двигаются, но и не спят полностью. Осторожно, но твердо используя зеркала для прицеливания, прижмите плоскую гранулу заподлицо со стеклянной поверхностью под задней лапой мыши. Одновременно нажмите «Пуск» на таймере.

Когда мышь отходит от охлажденного стекла по вертикали или горизонтали, остановите таймер и удалите гранулу сухого льда. Однако, если мышь очень ненадолго перемещает лапу, а затем возвращает ее на охлаждающую поверхность, продолжайте измерять время и стимулировать до тех пор, пока мышь не сделает постоянное движение. Если мышь не отходит от остывшего стекла, прекратите раздражитель через 20 секунд.

Повторяйте эту процедуру тестирования до тех пор, пока не будет собрано по крайней мере три значения на каждой лапе животного для тестирования мышей при температуре 17 градусов Цельсия. Повторите эксперимент, как показано выше, но вместо того, чтобы наполнять алюминиевые коробки горячей водой, используйте влажный лед и расположите коробки примерно на расстоянии 0,25 дюйма от вольеров для тестирования мышей. При температуре 12 градусов по Цельсию используется сухой лед, но коробки размещаются на расстоянии 1,25 дюйма от корпусов.

Этот альтернативный протокол проверяет мышей по мере снижения температуры планшета, а не после ее стабилизации. Это позволяет нам протестировать адаптацию мышей в том виде, в каком она происходит после настройки устройства. Как и раньше, проведите эксперимент так, как описано выше, чтобы провести измерения при комнатной температуре.

После измерения исходных задержок при комнатной температуре. Используя ранее показанную процедуру, заполните пустые алюминиевые коробки сухим льдом и разместите их на расстоянии 1,25 дюйма от корпусов с обеих сторон. Наконец, повторите эксперимент, чтобы измерить задержку по мере охлаждения стеклянной пластины.

Снимая мерки как можно чаще. На этом графике показана средняя задержка вывода средств для мышей, начиная с 12 градусов по Цельсию, 17 градусов по Цельсию, 23 градусов по Цельсию или 30 градусов по Цельсию. Задержки вывода постоянны при всех температурах.

Обезболивающие эффекты можно измерить с помощью холодного теста сеялки, как показано здесь. Подкожная инъекция 1,5 мг на килограмм морфина увеличивает латентность абстиненции у мышей через 30 минут после инъекции, что измеряется с помощью двухстороннего иннова с помощью теста Бонферрони через 60 минут после инъекции. Существенной разницы между введением морфина и введением физиологического раствора нет.

Здесь также можно измерить гиперчувствительность мышей. Внутриплантовое введение 10 микролитров полного фрос-адъюванта значительно снижает латентность абстиненции у мышей через два и три часа после инъекции, что было измерено с помощью апостериорного теста двухфакторной иннова с бонферрони. Тем же мышам вводили подкожные инъекции морфина через 4 часа, и все латентные задержки отмены через 4,5 часа были значительно выше по сравнению с тремя часами, что было измерено с помощью односторонней инновации с проведенным апостериорным тестом.

После того, как морфин был метаболизирован через 5,5 часов после инъекции, у мышей, которым вводили CFA, все еще наблюдалась более низкая задержка отмены, чем у мышей, которым вводили физиологический раствор, что было измерено с помощью двустороннего теста inova with Bonferroni post-hoc. С помощью этого анализа адаптация к изменениям окружающей среды при охлаждении может быть измерена в режиме реального времени. Мыши дикого типа имеют такую же задержку вывода, как и стеклянная пластина охлаждается, что позволяет предположить, что они адаптируются к температурам охлаждения быстрее, чем это можно измерить с помощью CPA, который не имел существенных различий между какими-либо группами.

Однако, когда мышам вводили U 7 3 1 2 2 для блокирования гидролиза PIP two, их латентность уменьшается по мере снижения температуры пластины, что свидетельствует о нарушении адаптации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как измерить ощущение холода и адаптацию у бодрствующих свободно ведущих себя мышей. Не забывайте, что работа с сухим льдом может быть исключительно опасной, и что во время этого метода вам необходимо обеспечить надлежащую вентиляцию и очистку воздуха.