A Большой процедура Боковой Краниотомии для мезомасштабного широкоугольных оптического Визуализация активности мозга

Общая цель данной обширной латеральной краниотомии заключается в проведении визуализации в режиме реального времени на большой площади полушария коры головного мозга. Основным преимуществом этого метода является то, что для наблюдения открываются обширные области коры, которые могут быть использованы в сочетании с такими технологиями, как оптогенетика. Данный метод позволяет получить сведения о нейронной динамике как между отдельными клетками, так и между различными нейронными цепями мозга с разным временным и пространственным разрешением.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение из-за повышенного риска кровоизлияния и повреждения коры, поскольку твердая мозговая оболочка часто плотно прилегает к поверхности мозга и кровеносным сосудам. Данный метод может быть применен для изучения нейробиологических механизмов, лежащих в основе развития мозговых цепей и их изменений на протяжении жизни в ответ на новый опыт или такие патологии, как болезнь Альцгеймера или инсульт. Перед началом процедуры проавтоклавируйте все хирургические принадлежности и обеспечьте соблюдение стерильности на протяжении всей операции.

Убедитесь, что для проведения операции имеется достаточное количество буфера для мозга. Затем перенесите анестезированную мышь в установку с головным фиксатором и поместите ее на терморегулирующую грелку, настроенную на 37 °C. Зафиксируйте верхние резцы мыши в зубном держателе.

Затем поверните голову мыши влево примерно на 30 градусов, чтобы открыть правую латеральную сторону головы. После этого зафиксируйте голову мыши с помощью тупых концов ушных зажимов. Затем нанесите тальмическую мазь для предотвращения пересыхания роговицы.

Для уменьшения отека головного мозга внутримышечно введите дексаметазон в дозе 4 мг/кг. Протрите кожу в области хирургического вмешательства ватными тампонами, смоченными в 4% растворе хлоргексидина, трижды, а затем трижды — в 70% спирте. Подкожно введите лидокаин в области проведения краниотомии.

Под стереомикроскопом с помощью пинцета приподнимите кожу в одном миллиметре левее срединной линии сразу за ухом и сделайте небольшой горизонтальный разрез хирургическими ножницами. Выполните латеральный разрез длиной пять-шесть миллиметров в направлении правого уха, а затем сделайте разрез в сторону рострального конца головы. В месте первоначального разреза введите ножницы и сделайте разрез на 10 мм в ростральном направлении.

После этого сделайте надрез кожи вокруг правого уха и рядом с правым глазом, чтобы обнажить правую сторону черепа и височную мышцу. Убедитесь, что ширина обнаженной области составляет не менее семи миллиметров. Затем при необходимости дополнительно иссеките кожу для расширения операционного поля.

С помощью ватного тампона круговыми движениями протрите поверхность черепа, чтобы удалить надкостницу. Убедитесь, что надкостница удалена полностью и череп совершенно сухой, так как это критически важно для успешного прикрепления головной пластины. Затем с помощью пружинных ножниц и пинцета отделите височную мышцу от черепа.

Рассеките мышцу и отведите ее латерально до достижения чешуйчатой кости. Соблюдайте крайнюю осторожность, чтобы не повредить поверхностную височную вену, которая проходит на уровне чешуйчатой кости рядом с глазом, иначе может возникнуть кровотечение. Остановите кровотечение с помощью гельфома, предварительно смоченного в буфере для мозга.

При сильном кровотечении используйте термокоагулятор. Нанесите капли бутилцианоакрилатного клея на места кровотечения. Чтобы начать эту процедуру, сначала отметьте брегму для ориентирования подлежащих областей мозга, нанесите этилцианоакрилатный клей по нижнему краю головной пластины и приклейте пластину над областью краниотомии.

После этого заполните пространство между черепом и головкой зажима стоматологическим цементом, оставив открытой только область краниотомии. Дождитесь высыхания и затвердевания стоматологического цемента. Затем наметьте область краниального окна, осторожно процарапав поверхность черепа стоматологическим бором.

Осторожно проведите сверлом вдоль первоначальной насечки, чтобы углубить ее, следя за тем, чтобы сверло не прошла сквозь череп в ткани мозга. При этом каждые несколько минут чередуйте сверление с промакиванием поверхности черепа увлажненными скрученными салфетками. Этот крайне сложный начальный этап требует от хирургов аккуратного просверливания старого черепа, чтобы освободить его для удаления, не повредив при этом подлежащую кору.

Медленные движения приводят к рыхлости, плавные — к скорости. В процессе сверления периодически проверяйте череп на предмет деформации, осторожно надавливая на него пинцетом или неподвижным сверлом. При появлении первых признаков прогиба кости прекратите сверление и погрузите все окно в буфер для мозга.

Подождите не менее пяти минут перед удалением черепа, чтобы кость размягчилась и снизилась вероятность прилипания твердой мозговой оболочки к кости, что облегчит процесс удаления черепа. Затем приступайте к удалению черепа, начиная с переднего края. Осторожно отделите размягченную кость черепа от твердой мозговой оболочки с помощью пинцета.

Когда кость станет подвижной и будет свободно лежать на твердой мозговой оболочке, крепко захватите ее пинцетом и поднимите. Следите за тем, чтобы кость ни в коем случае не проникла в ткани мозга. С помощью пинцета и пружинных ножниц аккуратно разорвите и иссеките твердую мозговую оболочку.

Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить паренхиму головного мозга и кровеносные сосуды. Продолжайте процедуру до полного удаления твердой мозговой оболочки из области краниального окна. При правильном выполнении поверхность мозга будет выглядеть очень чистой, с четко выраженными сосудами и без каких-либо повреждений.

Обработайте покровное стекло 70% ethanol, затем аккуратно просушите его с помощью баллончика со сжатым воздухом. Убедитесь, что стекло полностью чистое, без пятен и пыли. Затем приготовьте 1,3% agarose, нагрев 200 миллиграммов порошка agarose, растворенного в 15 миллилитрах буфера для мозга.

Поместите термометр в горячий агарозный гель и охладите его до температуры чуть выше точки затвердевания, примерно до 40 °C. Охлаждение можно ускорить, промывая пробирку холодной водой, следя за тем, чтобы вода не попала в агарозу. Осторожно перемешивайте раствор термометром, контролируя температуру.

Непосредственно перед нанесением агара удалите буфер для мозга из краниальной лунки. Убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха или частиц, так как они будут мешать визуализации. Теперь наберите агарозу с помощью наконечника для переноса и нанесите её непосредственно на мозг.

Затем быстро накройте поверхность покровным стеклом и зафиксируйте его каплями агарозы по углам. Здесь представлена фотомикрография широкой односторонней краниотомии, где брегма отмечена белым кругом на каждом изображении. Паттерны активации коры показаны у мыши, находящейся под воздействием 0,5% isoflurane, после стимуляции контралатеральных вибрисс, слуховой стимуляции, стимуляции контралатеральной передней конечности, стимуляции контралатеральной задней конечности и зрительной стимуляции контралатерального глаза с помощью светоизлучающего диода.

Активация срединных структур наблюдалась при всех формах сенсорной стимуляции через 10–25 миллисекунд после активации первичной сенсорной коры. После освоения данной техники ее выполнение занимает от трех до четырех часов. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости минимизировать потерю крови и обеспечить сохранность коры головного мозга.

С помощью данной процедуры другие методы визуализации, такие как оптическая визуализация, могут помочь ответить на важные вопросы, например, о том, как спонтанная активность влияет на нейронную динамику в здоровом мозге и при патологиях. После разработки этот метод открыл исследователям в области системной нейробиологии возможность изучать взаимодействия и нейронную динамику между широко разнесенными областями коры головного мозга мышей. В данном видео показано, как выполнить обширную латеральную трепанацию черепа мыши с минимальной потерей крови и повреждением коры, что позволит вам собрать необходимые данные для решения наиболее актуальных научных задач.