Быстрая и надежная Трубопровод Бактериальный Транскриптом Анализ Case Study: серин-зависимой регуляции генов в Пневмококк

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить обзор транскриптомных изменений у бактерий, возникающих в конкретных условиях. Это достигается путем выращивания и сбора бактериальных клеток в определенных условиях. Затем из собранных клеток выделяется общая РНК, а из РНК производится КДНК.

Затем CDNA маркируются и гибридизуются с микропредметными стеклами собственного производства. Наконец, предметное стекло промывается, после чего слайды сканируются и анализируются. В конечном счете, микрочип используется для отображения транскриптомных изменений в бактериальных клетках в конкретных условиях.

Основное преимущество технологии ДНК-микрочипов перед другими существующими методами изучения экспрессии генов, такими как QPCR или северный блоттинг, заключается в том, что она обеспечивает глобальный обзор всех транскриптомных изменений, происходящих при конкретных условиях. Это быстро, надежно и относительно дешево. Продемонстрируют процедуру Мохаммед Сал и Айрон Манзу, студенты PSD из моей лаборатории по молекулярной генетике После размораживания, s pmo, ED 39 клеточных гранул и суспендирования Resus в 400 микролитрах te в соответствии с текстовым протоколом, приготовьте следующие в пробирках с завинчивающейся крышкой без РНК, 0,5 грамма стеклянных шариков, 50 микролитров 10% SDS 500 микролитров ранее приготовленного фенолхлороформа и ресуспендированные клеточные гранулы.

Чтобы разбить клетки, поместите пробирки в бисерную машину и дважды гомогенизируйте по 60 секунд, поместив их на лед на одну минуту между импульсами, затем центрифугируйте образцы при 10 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Переложите верхнюю фазу в свежую пробирку, и при 500 микролитрах хлороформа i a, a и центрифугируйте еще пять минут. Пипетка 500 микролитров из верхней фазы в свежие пробирки.

Добавьте два объема буфера, связывающего лизис, и перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Затем с помощью набора для выделения РНК изолируйте общую РНК в соответствии с протоколом производителя, чтобы удалить загрязняющую ДНК из РНК. Добавьте 100 микролитров Da в одну смесь и инкубируйте при температуре от 15 до 25 градусов Цельсия в течение 20-30 минут.

С помощью набора RN a's промойте очищенную РНК и Elute до объема 50 микролитров для проведения реакции стояния на коленях в 300 микролитровых ПЦР-пробирках. Смешайте общую РНК с двумя микролитрами случайных мономеров и при необходимости используйте воду без нуклеаз, чтобы довести объем до 18 микролитров. Инкубируйте смесь для коленопреклонения при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Затем охладите реакции при комнатной температуре в течение 10 минут и дайте им быстро раскрутиться, прежде чем поместить пробирки на лед как минимум на одну минуту. Чтобы провести обратную транскрипцию CDNA, приготовьте смесь для обратной транскрипции, соедините 18 микролитров смеси с 12 микролитрами мастер-смеси и инкубируйте реакцию при температуре 42 градуса Цельсия в течение от двух до 16 часов. Уменьшите реакцию мРНК, добавив три микролитра 2,5 моляра и OH, и поместите ее при температуре 37 градусов Цельсия примерно на 15 минут.

Затем добавьте 15 микролитров двух молярных куч свободной кислоты для нейтрализации NAOH. Затем, используя колонки для очистки ПЦР для очистки CDNA с помощью спектрофотометра, измерьте концентрацию CDNA для маркировки CDNA. Добавьте пять микролитров среднегомерного реактивного красителя к 20-60 нанограммам на микролитр КДНК.

Поместите смесь в темноту и инкубированную комнатную температуру на 60 – 90 минут, перед тем как использовать колонки для очистки PR от крапленного CDNA в 50 микролитрах эволюционного буфера с помощью спектрофотометра, убедитесь, что концентрация меченых CDNA составляет не менее 0,5 пикомолей на микролитр в общем объеме 50 микролитров. После подготовки застенчивого буфера, согласно текстовому протоколу, разогрейте буфер до 68 градусов Цельсия не менее 30 минут. Чтобы приготовить образец, соедините равное количество меченых CDNA, затем используйте вакуумные концентраторы при высокой температуре, чтобы уменьшить объем до семи микролитров или меньше.

В то же время, чтобы очистить лифтерные клинки для уменьшения фонового сигнала, используйте мыло и большое количество водопроводной воды, а затем 100% этанол после сушки феном, поместите один из них на слайд белой тефлоновой подкладкой вниз. Далее растворите высушенные образцы красителя в семи микролитрах H2O и инкубируйте при температуре 94 градуса Цельсия в течение двух минут. Сразу же добавляем 35 микролитров разогретого застенчивого буфера, аккуратно перемешиваем и отжимаем на максимальной скорости в течение одной минуты.

Чтобы пеллеты выпали в осадок, предварительно нагрейте зонд до 68 градусов Цельсия в течение примерно пяти минут перед загрузкой. Чтобы собрать ползунок и слип подъемника, поместите гибридизационный держатель ползуна на термоблок при температуре 50 градусов Цельсия. Поместите предметные стекла с микрочипом ДНК с подъемным накладкой на нагреваемый держатель гибридизационного стекла и предварительно нагрейте предметное стекло с помощью подъемного стекла в течение минуты.

Затем как можно быстрее добавьте 40 микролитров мишени для образца в конец предметного стекла. Позвольте жидкости течь между стеклянными поверхностями под действием капиллярной силы. Теперь извлеките предварительно прогретую кассету для гибридизации из печи для гибридизации и закройте машину.

Затем поместите в кассету для гибридизации фильтровальную бумагу, смоченную на трех миллилитрах двух XSSC. Аккуратно поместите гибридизационный держатель слайдов со слайдами в кассету для гибридизации. Закройте кассету для гибридизации и поместите ее обратно в печь для гибридизации и инкубируйте от 16 до 18 часов.

Для мытья слайдов подготовьте свежие буферы для стирки один, два и три, и поместите их при температуре 30 градусов Цельсия. Чтобы убедиться, что SDS растворится после завершения инкубации, осторожно погрузите предметные стекла как можно быстрее в пробирку Falcon, наполненную 50 миллилитрами промывочного буфера, по одному стакану до тех пор, пока стекло не остановится на дне пробирки. После того как подъемник скользит, опускается на дно трубки, не царапая массив, с помощью пинцета снимаем горку и ставим ее в стойку моечной станции.

Сразу же используйте 500 миллилитров буфера для стирки одного для мытья стекол в течение пяти минут. Затем переложите предметные стекла в буфер для стирки два на 20-30 минут, прежде чем переложить их на 500 миллилитров буфера для промывки трех на пять минут. Наконец, высушите предметные стекла при 2000 об/мин в течение двух минут перед проведением анализа микрочипов.

В соответствии с текстовым протоколом по изучению влияния L-серина на весь транскриптом S. pneumonia был проведен микроматричный анализ штамма D 39 Wildtype штамма D 39, выращенного в CDM со 150 микромолями L-сене, по сравнению с тем, который был выращен в 10 миллимолярных л сене в той же среде. В этой таблице перечислены концентрации общей РНК, выделенной из каждой культуры, как показано на этом рисунке. После удаления ДНК было исследовано качество РНК.

Эти две полосы представляют РНК из 150 микромолярного невода, а эти две полосы — из культур, выращенных с 10 миллимолярным неводом. Наличие двух прозрачных полос свидетельствует о хорошем качестве РНК. Концентрации КДНК, синтезированных из общей РНК, записаны в этой колонке, а образцы со средним значением реактивного красителя, меченные здесь.

На этом рисунке представлен анализ диаграммы рассеяния среднего отношения реактивных кристаллов AM, и данные были дополнительно проанализированы для снижения шума. В этой таблице обобщены результаты исследований с использованием микрочипов после применения критериев «больше или равно двукратной разнице» и значения P менее 0,001. Как видно из рисунка, ряд генов дифференциально экспрессировался в присутствии минимального L-серина по сравнению с максимальным После этой процедуры.

Другие методы, такие как beag, анализы электроцитов, QPCR, нокаут и/или сила экспрессии, могут быть использованы для ответа на следующие вопросы После его разработки. Этот метод позволил исследователям VFR в области молекулярной и клеточной биологии изучить регуляторные сети и механизмы в RAM-положительном.