Генерация лимфобластный микрочастиц и выявление их проапоптозный Влияние на эпителиальными клетками дыхательных путей

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы проиллюстрировать производство in vitro лимфоцитарных микрочастиц или ЛМП из клеточной линии Т-лимфоцитов и продемонстрировать их проапоптотическое действие на эпителиальные клетки дыхательных путей. Это достигается путем предварительного производства LMP. Затем изолированные LMP характеризуются с помощью факсимильного анализа.

Затем культивируют экспланты бронхиальной ткани. Наконец, проводится лечение НПМ на бронхиальных эксплантах. В конечном счете, гистопатологические исследования, такие как гемат, тоин и эозин, а также обнаружение двухклеточной гибели NC, используются для выявления индуцированного ПМП повреждения эпителиального слоя бронхов и апоптоза эпителиальных клеток.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как выделение микрочастиц из периферической крови человека, заключается в том, что мы можем выполнять крупномасштабную генерацию микрочастиц, полученных из клеточной линии in vitro. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что критические этапы культуры бронхов нелегко подготовить. Для начала культивирования.

Клетки CEMT в четырех колбах T 1 75 каждая, содержащих по 150 миллилитров свежей, средней и инкубируются при 37 градусах Цельсия до плотности 2 миллиона клеток на миллилитр. Соберите ячейки из каждой колбы центрифугированием при 200 умноженных на G в течение пяти минут и согнуть 300 раз по 10 к шести ячейкам в новую Т 1 75 колб, содержащих 150 миллилитров свежей среды. Чтобы сохранить плотность в 2 миллиона клеток на миллилитр, добавьте в среду 37,5 микролитров актина мицина D в конечной концентрации 0,5 микрограмма на миллилитр и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов.

Переложите всю питательную среду в конические пробирки объемом 50 миллилитров и раскрутите клетки при 750-кратном G в течение пяти минут. Затем переложите надосадочную жидкость в конические пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при 1500-кратном G в течение 15 минут для удаления крупных фрагментов клеток. Затем перелейте надосадочную жидкость в флакон объемом 250 миллилитров и ультрацентрифугу при 12 000 G в течение 50 минут.

Затем выбросьте надосадочную жидкость и соберите гранулы. Используйте 40 миллилитров стерильного PBS для промывки гранул, обогащенных LMP, в пробирке объемом 50 миллилитров и центрифугируйте при 12 000 G в течение 50 минут. Повторите этот шаг дважды.

Соберите надосадочную жидкость из последней мойки, чтобы использовать ее в качестве управления автомобилем, с помощью одного миллилитра PBS. Суспензируйте гранулы и переложите в стерильную микропробирку объемом 1,5 миллилитра и храните изолированные LMP при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы охарактеризовать микрочастицы с помощью факсимильного анализа, начните с подготовки двух образцов нексинового буфера, одного с хлоридом кальция и одного без кальция.

В факсимильной трубке разбавьте один микролитр LMP в 44 микролитрах нексинового буфера с хлоридом кальция. Приготовьте еще одну пробирку, используя нексиновый буфер без хлорида кальция. Далее добавляем по пять микролитров X и V sci по пять в каждую пробирку и хорошо перемешиваем, выдерживаем в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.

После инкубации используйте 400 микролитров жидкости для оболочки гриппа. Чтобы остановить реакции, добавьте 10 микрон семимикронной суспензии счетных шариков в качестве внутреннего стандарта в каждую пробирку. Для получения абсолютного подсчета установлены вентили относительного размера, FSCH и относительная зернистость SSCH и точечный график на проточном цитометре.

Использование калибровки по размеру флуоресцентных бусин в один микрометр для вентиля один и подсчет бусин в семь микрометров. Для второго вентита проанализируйте образец LMP на графике F-S-C-H-S-S-C-H с использованием установленных вентилей и четырех каналов FL для точечной диаграммы аннексина путем получения сигнала до тех пор, пока не будет достигнуто 10 000 счетных бусин во втором походе, определите положительные события ex NV LMP в нексиновом буфере, содержащем хлорид кальция, и вычтите события LMP в нексиновом буфере без хлорида кальция. Рассчитайте абсолютное число узловых маржинальных мышей на основе следующего уравнения.

Использует скальпель Dumont сверхтонкий пинцет и хирургические ножницы для асептического рассечения легочной ткани. Аккуратно удалите паренхиму и кровеносные сосуды. Далее рассекайте бронх, погруженный в жидкость для промывки тканей, и отделяйте бронхи диаметром от одного до 2,5 миллиметров от периферических тканей легких.

С помощью скальпеля разрежьте бронхиальную ткань на бронхиальные ряды толщиной около пяти миллиметров с помощью стерильных изогнутых микрорассекающих щипцов. Поднимите фрагменты бронхов и положите их на поцарапанные участки заранее приготовленной посуды. Согласно текстовому протоколу, удалите ткань из промывочной среды и инкубируйте фрагменты при комнатной температуре около пяти минут, чтобы они могли прилипнуть к посуде.

Добавьте 10 миллилитров полной лечебной среды в каждую чашку и поместите их в модульную камеру инкубатора с контролируемой атмосферой и смесью с высоким содержанием кислорода, промойте камеру, затем поместите ее в настольный орбитальный инкубатор и встряхивайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов со скоростью 10 циклов в минуту, чтобы среда могла периодически течь по фрагментам. После инкубации наблюдайте за экспланом тканей под фазовым контрастом и микроскопом с инвертированным светом. Выберите бронхиальный контур с полным движением тонких волос и живым бронхиальным эпителием для последующего лечения НПМ.

Для лечения НПМ подсчитайте только что выбранный бронхиальный контур и отметьте каждую лунку 12-луночного планшета для культуры тканей. Для каждого эксплана переложите 0,5 миллилитра готовой питательной среды в стерильную эйноровую пробирку. Затем добавьте по 25 мкл и запаса на одну операционную обработку или добавьте 25 мкл контрольной машины.

Для контроля экспланты хорошо перемешать, слегка постукивая по трубке. Переложите смешанную среду в каждую лунку маркированной 12-луночной тканевой культуральной пластины с помощью изогнутых микрорассекающих щипцов. Перенесите каждый выбранный бронхиальный x эксплан в каждую лунку планшета для культивирования тканей.

Продолжайте инкубацию в модульной камере инкубатора с контролируемой атмосферой при температуре 37 градусов Цельсия с легким встряхиванием через 24 часа. С помощью PBS трижды промыть EXPLAN и приступить к фиксации h и e окрашиванию и туннельному анализу. В соответствии с текстовым протоколом, показанным здесь, LMP были охарактеризованы окрашиванием nexin V с помощью факсимильного анализа и стробированы с использованием гранул размером в один микрометр, где 97% MPP были в nexin V sci-fi положительными.

Как правило, в соответствии с этим протоколом было получено около 2,5 миллиграммов LMP. Эксплан бронхиальной ткани шести мышей типа C 57 black был подвергнут лечению носителем и LMP. На этом рисунке гистопатологический анализ срезов бронхов показывает влияние ПМЦ на структурную целостность бронхиального эпителия.

Под контролем. Поясняйте, что бронхиальный эпителий в основном не был поврежден. Тем не менее, в эксплантах, обработанных LMP, поверхностный слой эпителиальных клеток был поврежден или утрачен, а также наблюдалось значительное снижение высоты и плотности эпителиальных клеток, как видно здесь.

Туннельное положительное окрашивание, маркер апоптоза, было более выраженным в бронхиальном эпителии, обработанном LMP, по сравнению с контрольной тканью. При проведении этой процедуры важно помнить о работе в стерильных условиях при производстве микрочастиц и проведении эксплан-культуры тканей.