Перфорированные патч-зажим записи из мышей Обонятельные сенсорные нейроны в неповрежденном нейроэпителии: Функциональный анализ нейронов выражая идентифицированного одоранта рецептор

Общая цель этой процедуры заключается в измерении изменений мембранных свойств обонятельных сенсорных нейронов в ответ на стимуляторы запаха. Это достигается путем предварительного рассечения обонятельного эпителия и переноса его в перфузированную камеру. Второй шаг — найти и выбрать интересующий вас OSN под микроскопом.

Затем дендритный набалдашник выбранного OSN зажимается и анализируется при стимуляции одорантами. В конечном счете, перфорированное заплаточное зажимание дендритных ручек OSN характеризует функциональные свойства OSN на мембранном уровне. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в областях обоняния, такие как запись обонятельных, сенсорных нейронов, экспрессия определенных рецепторов обоняния, а также запись патч-зажима.

Предоставьте информацию о мембранных свойствах этих нейронов. Приготовьте стимулирующие пипетки из стекла толщиной в один миллиметр или приобретите их предварительно вытянутыми с помощью пламени. Согните шесть пипеток примерно на один сантиметр от кончика под углом 45 градусов.

Затем расположите шесть пипеток с изогнутым концом вокруг седьмой прямой пипетки, используя в качестве ориентира ушко, и оберните их термоусадочной трубкой. Нагрейте термоусадочную пленку на другом конце пипетки. Нанесите еще термоусадочную пленку.

Таким образом, получается препо с семью бочками, стимулирующими пипетку. Теперь с помощью многоствольного полярного дозатора потяните за семь стволов стимулирующую пипетку. После натяжения укрепите сборку белым клеем вокруг проушины.

Затем дайте клею высохнуть в течение ночи от требуемых растворов. Раствор нистатина необходимо сделать свежим непосредственно перед его использованием. При необходимости взвесьте три миллиграмма нистатина и добавьте его к 50 микролитрам ДМСО.

Затем перемешайте вихревую смесь в течение 20 секунд. Далее обрабатывайте смесь ультразвуком в течение двух-трех минут, чтобы обеспечить полное разбавление. Теперь добавьте 20 микролитров смеси к пяти миллилитрам внутриклеточного исходного раствора.

Микширование Vortex в течение 20 секунд, за которым следует две-три минуты ультразвуковой обработки. Затем охладите рабочий раствор на льду и держите его защищенным от света подготовленным. Таким образом, рабочий раствор хорош в течение нескольких часов.

Загрузите в снаряженный микропленкой шприц рабочий раствор. Он будет хорош в течение часа использования, пока не будет использован. Тем не менее, сохраните заряженный шприц, держа его на льду.

Теперь потяните за несколько записывающих электродов с длинными шейками и отверстиями в два микрона. Цель состоит в том, чтобы получить сопротивление от 15 до 20 мега Ом после загрузки раствором нистатина. Наконец, загрузите в стимулирующую пипетку одорант, разведенный в звонке. Решение.

Для этого протокола используйте мышей в возрасте от двух до четырех недель. В данной презентации используются мыши, экспрессирующие или IRES tau GFP. Все нейроны, выражающие интерес или представляющие интерес, будут помечены GFP.

Этот метод может быть использован или выражен во всех зонах. Тем не менее, вскрытие и запись будут более легкими для ОШ, экспрессируемых в дорсальной зоне. Начните с обезболивания, а затем обезглавливайте мышь.

Результат этого протокола зависит от качества вскрытия. Эти этапы вскрытия должны быть как можно более короткими и точными. Чтобы начать операцию, с помощью препарирующих ножниц сделайте продольный разрез вдоль тыльной стороны.

Раздвиньте кожицу, чтобы снять ее. Затем разрежьте вдоль нижней челюсти и сделайте корональный разрез параллельно зубам. Таким образом, удаляют верхние резцы зубов.

Теперь сделайте корональный разрез вокруг головы, за глазами, отбросьте заднюю часть головы и перенесите переднюю часть на ледяные звоны. Теперь под микроскопом вскрытия изолируйте перегородку в течение пяти-10 минут. Начните с продольного разреза по брюшной стороне.

Затем разрежьте спинные кости продольно вдоль дорсальной боковой стороны носовой полости. Далее удалите большую часть костей и нёбо. Перенесите изолированную перегородку и приложите эпителий к емкости с насыщенными кислородом кольцами комнатной температуры.

В течение пяти минут сделайте последние приготовления перед записью. Раствор не должен быть слишком теплым, иначе препарат будет выглядеть поврежденным. Получить доступ к нейроэпителию для записи.

Сначала с помощью щипцов отслаивается эпителий от подлежащей перегородки. Затем с помощью микроножниц Vanna разрежьте передний конец перегородки, чтобы освободить эпителий. Теперь аккуратно удалите сошник носового органа.

Отрежьте его в том месте, где он прикреплен дорсально. Теперь выделенный эпителий можно переместить в камеру регистрации слизью вверх. Оказавшись на месте, используйте арфу, чтобы расплющить ткань.

Затем перенесите камеру в вертикальный микроскоп. Визуализируйте нейроэпителий под объективом для погружения в воду с 40-кратным увеличением, постоянно перфузируя его свежими звонарями комнатной температуры. Чтобы начать поиск интересующих клеток, которые в данном случае экспрессируют EGFP, используется свет 480 нанометров для сканирования клеток, излучающих свет в диапазоне от 530 до 550 нанометров.

Целевые дендритные бугорки и osn при рассмотрении при 80-160 x в светлом поле должны быть четко различимы от поддерживающих ячеек. Теперь нагрузите электрод раствором S-статина. Выдавите все образующиеся пузырьки и прикрепите электрод к держателю.

Теперь приложите положительное давление. Ожидаемое сопротивление составляет от 15 до 20 мегаом. Затем подведите электрод к ячейке, сохраняя положительное давление.

Когда сопротивление увеличится примерно до 40 мегаом, сбросьте давление и приложите небольшое отрицательное давление. Если изготовлено гига-уплотнение, потенциал мембраны должен быть зажат примерно на уровне минус 75 милливольт. Теперь, когда ячейка открыта, приступайте к эксперименту.

Применяйте стимуляцию, протоколы и перфузию с фармакологическим лечением по мере необходимости для тестирования с использованием одного одоранта. Запишите от 200 до 500 миллисекунд спонтанной активности. Нанесите одорант на 500 миллисекунд, а затем измеряйте реакцию в течение 10 секунд, используя описанный протокол.

MOR 23, экспрессирующие нейроны, помеченные EGFP, были запатированы и стимулированы различными концентрациями al. В режиме зажима тока lyal является лигандом для MOR 23. В качестве альтернативы элементы моделировались в режиме зажима напряжения.

При регистрации в режиме напряжения контролировались различные характеристики. Для количественной оценки реакции, как это делается классически в электрофизиологии с использованием максимальной амплитудной реакции, дозовая реакция была построена с использованием уравнения Хилла. Эти результаты предоставляют информацию о свойствах кодирования каждого OSN, включая порог обнаружения, временной, динамический, динамический диапазон и уровень насыщения.

После освоения диссекционная часть этой техники может быть выполнена в течение 10-15 минут. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как исследовать функциональные свойства обонятельных сенсорных нейронов, экспрессирующих определенные рецепторы запаха у мышей.