Применяя Стереотаксическая техника инъекций по изучению генетических эффектов на животных Поведения

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить, как модуляция экспрессии гена в целевой области влияет на поведение животных. Это достигается путем создания лентивируса для модуляции экспрессии гена-мишени. Второй шаг заключается в использовании стереотаксической инъекции для введения лентивируса в определенную область мозга грызунов.

Следующие виды поведения, такие как тревога и депрессия, могут быть количественно измерены с использованием установленных поведенческих парадигм. Заключительным этапом является проведение гистологии для подтверждения правильного места инъекции. В конечном счете, стереотаксическая инъекция в сочетании с поведенческой оценкой может показать, как конкретный ген в целевой области может влиять на поведение мышей.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами заключается в том, что ученые могут изменить экспрессию одного гена в небольшой целевой области, а затем оценить изменения в поведении мышей. Чтобы начать эту процедуру, поместите мышь под наркозом в стереотаксический аппарат, зафиксируйте передние зубы на переднем зажиме и закрепите челюсть. Затем вставьте ушные планки в ушные проходы для того, чтобы полностью стабилизировать голову.

Далее подложите под мышь грелку, чтобы регулировать температуру ее тела. На протяжении всей процедуры ставьте искусственные слезы на глаза грызуна, чтобы не допустить пересыхания. После этого тщательно очистите операционную область, предварительно круговыми движениями втирая ватным тампоном 10%-ный повидон-йод.

Затем таким же образом втереть в место операции 70% этиловый спирт. Повторите эту процедуру очистки еще два раза. Как только мышь будет подготовлена, откройте стерильную сумку для оборудования.

Меняйте перчатки перед тем, как прикасаться к приборам. Затем достаньте стерильную салфетку и положите инструменты на ткань. Теперь аккуратно обхватите кожу мыши кровью и конечными щипцами и сделайте на ней надрез с помощью скальпеля.

Начните разрез примерно на 1,5 сантиметра выше ушей и протяните примерно на 0,5 сантиметра ниже ушей, чтобы обнажить BGMA. После того, как BGMA визуализирована, используйте стерильный ватный наконечник, чтобы аккуратно удалить кровь, покрывающую поверхность черепа. Затем с помощью двух ватных кончиков протолкните кожу к бокам головы.

Далее в вытяжном шкафу наполните шприц вирусом, который будет вводиться. Убедитесь, что внутри не застряли пузырьки. Затем поместите шприц в стереотаксический аппарат, убедившись в его полной фиксации.

После этого медленно опустите шприц до тех пор, пока он не окажется прямо над поверхностью черепа. Затем переместите кончик стерильной иглы шприца на пересечение B bgma и межсельской линии. Установите эту точку равной нулю.

Впоследствии задайте координаты интересующей области. Переместите иглу шприца к целевому месту сверления. Затем поместите сверло прямо над целевым местом под углом 45 градусов к черепу и начните сверление.

Будьте осторожны и не сверлите мозг, чтобы предотвратить повреждение коры головного мозга. После этого смойте кровь из отверстия стерильным ватным наконечником. Опустите шприц так, чтобы кончик сидел прямо на поверхности мозга.

Установите координату DV равной нулю, затем опустите шприц на нужную глубину. Теперь начните инъекцию со скоростью 0,2 микролитра в минуту. После завершения инъекции подождите около двух минут, чтобы убедиться, что остаточный вирус впитался.

Затем медленно поднимите шприц. С помощью ватного наконечника смойте жидкость с места инъекции. После этого зашить кожу и вывести животное из стереотаксической системы.

Держите мышь на грелке до тех пор, пока она не проснется, и при необходимости вводите дополнительный анальгетик. В этой процедуре получается пластиковый квадратный манеж. Перед экспериментом очистите арену с 70%-ным этиловым спиртом.

Затем поставьте арену на пол и убедитесь, что освещение настроено на минимизацию теней и бликов. Далее отрегулируйте настройки обнаружения так, чтобы мышь была видна на экране. После этого включите камеру, чтобы записать поведенческое задание, и расположите мышь ближе к центру передней части арены так, чтобы мышь была обращена к стене.

Установите таймер на пять минут и отойдите от арены или покиньте комнату. Через пять минут перенесите мышь обратно в клетку. Используйте 70%-ный этиловый спирт для тщательной очистки поля, прежде чем приступить к следующему животному.

Теперь наполните двухлитровое прозрачное ведро водой с температурой 22 градуса. Поставьте ведро на пол и убедитесь, что освещение настроено на минимизацию теней и бликов. Если вы используете программное обеспечение для слежения, расположите камеру прямо над ковшом.

Отрегулируйте настройки программного обеспечения так, чтобы мышь была хорошо видна на экране. Затем включите камеру, чтобы записать поведенческое задание. Аккуратно поместите мышку в середину ведра с водой так, чтобы ее передние лапки.

Сначала коснитесь воды и не дайте ее голове погрузиться в воду. После этого установите таймер на шесть минут, прежде чем отойти от поведенческой зоны. Через шесть минут достаньте мышь из ведра, вытрите лишнюю воду, прежде чем поместить ее обратно в клетку.

Вот репрезентативный срез мозга, который иллюстрирует успешную инъекцию вируса в зубчатую извилину. На этом рисунке показано количество времени, которое контрольная и экспериментальная мыши провели в центре нового открытого поля. Экспериментальные мыши проводили значительно меньше времени в центре арены, что указывает на фенотип тревоги, и этот рисунок показывает количество времени, в течение которого контрольная и экспериментальная мыши были неподвижны в тесте на принудительное плавание.

Экспериментальные мыши существенно не отличались от контрольной группы по количеству времени, проведенного в неподвижном состоянии. После просмотра этого видео зрители должны иметь хорошее представление о том, как использовать стереотаксические инъекции для оценки поведения грызунов.