Используя антиген капсида-РЕГИСТРАЦИИ Стратегию развития подходов аденовируса серотипа 5-Vectored вакцин

Общая цель данной процедуры заключается в использовании стратегии инкорпорации антигенных капсидов для разработки подходов к векторной вакцине аденовируса серотипа пятого типа с использованием рекомбинантного двухвалентного аденовирусного вектора в качестве доказательства принципа, используя стратегию инкорпорации антигенных капсидов, для конструирования модифицированной плазмиды используются несколько этапов клонирования, A D пять R один K-W-S-H-V-R пять шипов. Далее идет двухвалентный аденилвирусный вектор. R one K был HVR пять.

Хисс спасается, размножается и очищается. Затем характеризуются титры вируса и антигенное отображение инкорпорированных антигенов на вирусном капсиде. Наконец, потенциал вирусного вектора Divalent Aden по обходу нейтрализации D 5-положительной сывороткой оценивается с использованием стратегии инкорпорации антигена капсида.

Для создания модифицированной плазмиды используются несколько этапов клонирования: A D five R one K-W-A-S-H-V-R пять шипов. Сегодня мы продемонстрируем стратегию инкорпорации антигена капсида. Эта стратегия выгодна по сравнению с другими стратегиями, такими как метод экспрессии трансгенов, потому что она не только отображает интересующий антиген в пленке аденовируса в виде белка, но и обеспечивает устойчивый гуморальный ответ против этого антигена.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы создания аденовируса, модифицирующего кап, трудно освоить, поскольку многие переменные вносят свой вклад в разработку рекомендуемых вирусных векторов, такие как выбор ферментов рестрикции, хрусталик или энергия, представляющая интерес у других. Сегодня будут два моих постдока, доктор Лин Лин Гу и доктор Нитра Фэрроу. Также Александр Крен, научный сотрудник лаборатории: «Чтобы построить плазмиду шаттла, добавьте по шесть единиц GE One и CCC от одного до шести микрограммов фрагмента HVR one KWA.

Инкубируйте реакцию пищеварения при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Растворите фрагмент пищеварительной системы в геле 2%agros с помощью электрофореза и используйте набор для экстракции геля ДНК в соответствии с протоколом производителя для очистки фрагмента. Затем лигатируют 12 нанограммов очищенного фрагмента в сайты a G one и ACC one из 100 нанограммов ранее сконструированной плазмиды челнока.

HVR пять шипит шесть pH пять с и реакционный объем 10 микролитров при комнатной температуре в течение двух часов. Затем добавьте один микролитр реакции лигирования к 50 микролитрам электрокомпетентных DH пяти альфа-элементов, электровосемь перед добавлением 950 микролитров среды SOC. Инкубируйте трансформированные клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение одного часа, прежде чем распределить от 100 до 200 микролитров культуры на планшете LB CANY.

Инкубировать в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Используйте по шесть единиц Echo R one и PME One, чтобы переварить шесть микрограммов очищенной челночной плазмиды при 37 градусах Цельсия в течение трех часов. После очистки фрагмента, содержащего гомологичные рекомбинационные плечи и двойной модифицированный экзон 5 гена, используют SUA one для линеаризации основной плазмиды, PAD 5, delta H 5 для проведения гомологичной рекомбинации.

Используйте электропорацию для совместного преобразования 100 нанограммов каждого из очищенного фрагмента челнока и основной плазмиды в 50 микролитров электрокомпетентных элементов BJ 5 180 3. Как было показано ранее в этом видео, на следующий день соберите примерно 10 колоний в три миллилитра жидкого LB, содержащего банк-мицин, и выращивайте их в течение ночи перед скринингом в соответствии с текстовым протоколом. Затем преобразуйте 100 нанограммов очищенной плазмиды в пять альфа-клеток DH, как было продемонстрировано ранее, чтобы спасти добавленный вирусный вектор.

Начните с использования PAC one для линеаризации 15 микролитров вектора в объеме 100 микролитров. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов после пищеварения. Извлечь линеаризованную плазмиду под вытяжным шкафом.

Добавьте равный объем фенолхлороформа, изоамилового спирта в реакционную центрифугу при 10 000 Г в течение одной минуты и соберите надосадочную жидкость перед повторением экстракции и открутите до извлеченного объема. Добавьте 300 микролитров 100% этанола и 10 микролитров ацетата при 10 000 г в течение 10 минут. Затем, выбросив надосадочную жидкость, добавьте 700 микролитров 70% этанола перед повторным вращением.

После того, как гранула была ресуспендирована и ДНК была количественно определена, трансфектируйте три микрограмма линеаризованной плазмиды вместе с коммерческим липосомальным реагентом для трансфекции в предварительно подготовленную колбу T 25 с 80% конфлюентными клетками HEK 2 93 в соответствии с инструкциями производителя. После инкубации в течение шести часов замените трансфекционную среду на полноценную среду, прежде чем возвращать колбу в инкубатор. Когда бляшки приобретут полный цитопатический эффект или CPE под стерильным колпаком, соскребите оставшиеся клетки с колбы и центрифугируйте культуру при 300 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем используйте один миллилитр среды, содержащей 2% FBS, для ресуспендирования клеточной гранулы. Затем разбейте клетки, проведя четыре раунда замораживания, затем центрифугируйте лизат при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость S, содержащую спасенный вирус, для размножения вирусного вектора в больших масштабах культуры.

Одна треть всего вирусного лизата из колбы Т25 в колбу Т-75, содержащую HEK 293 клетки. После полного развития CPE и сбора супината, как было показано ранее, размножите половину всего вируса в одном или нескольких экземплярах. Затем T 1 75 колб с клетками HK 2 93 размножают вирус, выделенный из колб T 1 75, в одну дюжину или более.

Т 1 75 колб клеток после приготовления по одной точке 33 грамма на миллилитр и 1,45 грамма на миллилитр. Растворы хлорида цезия добавляют четыре миллилитра, 1,33 грамма на миллилитр, хлорида цезия в ультрацентрифужную пробирку и добавляют четыре миллилитра, 1,45 грамма на миллилитр, хлорида цезия на дно той же пробирки. Добавьте четыре миллилитра супината вирусного лизата в верхнюю часть той же пробирки, затем центрифугируйте пробирку при 110 000 G и четырех градусах Цельсия в течение трех часов.

Это отделит зрелую нижнюю вирусную полосу от дефектной верхней вирусной полосы под капотом. Используйте иглу 33 калибра, прикрепленную к трехмиллилитровому шприцу, чтобы собрать нижнюю полосу. Затем с помощью пяти хиппи довести раствор до четырех миллилитров.

Затем, приготовив еще два градиента хлорида цезия, загрузите сверху разведенный вирус и центрифугируйте градиенты при 110 000 G и четырех градусах Цельсия в течение ночи. Под капотом. Соберите вирусную ленту так, как только что продемонстрировано.

Затем с помощью иглы 33 калибра и трехмиллилитрового шприца введите раствор вируса в диализную кассету. Помещают кассету в 700 миллилитров одного диализного буфера, приготовленного по текстовому протоколу, заменяя буфер четыре раза каждые три часа. Затем с помощью иглы и шприца.

Соберите вирусный раствор из кассеты, чтобы определить вирусный физический титр. Используйте буфер для лизиса вируса, чтобы разбавить вирус, и буфер для диализа, используемый в качестве фонового контроля, при 1 к 10 и 1 к 20 и инкубируйте все пробирки при 56 градусах Цельсия в течение 10 минут. Включите биофотометр и установите режим поглощения на оптическую плотность 260 нанометров.

Используйте буфер диализа, разбавленный до одного к 10, чтобы сбалансировать фоновый сигнал, нажав пустую кнопку. Наберите 10 плюс 90 на экране биофотометра. Замените пробирку на пробирку с вирусом, разбавленным до одного к 10, и считайте сигнал вируса, разбавленного до одного к 10.

Чтобы измерить разведение от одного до 20, используйте диализный буфер, разбавленный до одного к 20, чтобы сбалансировать фон, набрав пять плюс 95 на экране, прежде чем заменить буферную трубку на разбавленную вирусную трубку 1 к 20 и считывать сигнал. Умножьте два числа считывания вируса на 1,1 на 10 до 12 и рассчитайте средний титр в единицах VP на миллилитр на основе двух отдельных титров от двух разбавлений. Оцените вирус у мышей в соответствии с текстовым протоколом, чтобы продемонстрировать, демонстрирует ли спасенный вирус антигенный антиген ВИЧ и hist-метку на поверхности вирусного капсида.

Основной белок Геон пять. Исследование Eliza проводили с человеческим моноклональным антителом типа F five и мышиным моноклональным антителом против шипения соответственно, как показано на рисунке, как два антитела F five человека, так и антитело мыши против шипения, связанные с двухвалентной вирусной частицей с добавлением пяти веществ, в то время как связывание с отрицательным контролем отсутствовало. Для подтверждения данных Eiza был использован анализ крови с пятью векторами, поскольку как у человека, так и у мышиного антитела против шипения были обнаружены специфические полосы около 117 килодальтон.

В состав DIVALENT добавляют пять вирусов, что соответствует размеру белка Heon five. Для оценки потенциала сконструированного вируса сложения пяти для обхода нейтрализации путем сложения пяти положительных результатов был проведен анализ нейтрализации. Результаты показывают, что относительные люминесцентные единицы или rlu были в 12 раз выше, когда контрольный вектор add five обрабатывался без положительной сыворотки add five, чем когда его обрабатывали сывороткой, что позволяет предположить, что вирус был нейтрализован.

Напротив, была небольшая разница в использовании R для сконструированного двухвалентного вируса AD 5 между обработанными и необработанными образцами, что позволяет предположить, что сконструированный вирус избежал нейтрализации. После просмотра этого видео у вас должно быть более глубокое понимание подхода к включению антигена капсида для разработки вакцины с добавлением пяти векторов. В настоящее время мы используем эту стратегию в сочетании с редкими векторами серотипов.

Вы также можете это сделать.