Методы культивирования бедренной кости человека тканевых эксплантов для изучения клеток рака молочной железы колонизации метастатического ниши

Целью данной процедуры является изучение пролиферации, колонизации и миграции клеток рака молочной железы в модельной системе эксплантатов костной ткани человека. Это достигается путем выделения фрагментов трабекулярной костной ткани из хирургических образцов головки бедренной кости и их культивирования с клетками рака молочной железы, экспрессирующими люциферазу и зеленый флуоресцентный белок. Биолюминесцентная визуализация используется для измерения пролиферации клеток и подтверждения колонизации клеток рака молочной железы в фрагментах костной ткани.

Паттерны колонизации клеток рака молочной железы визуализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. Костный мозг может быть вымыт из фрагментов для анализа методом проточной цитометрии, с помощью тестов на люминесценцию и окрашивания. Миграцию клеток рака молочной железы в сторону культур тканей, супернатантов и фрагментов костной ткани измеряют в миграционных камерах Transwell с использованием биолюминесцентной визуализации. Кость является наиболее частым местом метастазирования рака молочной железы, и в конечном итоге данная модель открывает новые возможности для изучения клеток рака молочной железы в метастатической нише костной ткани.

Большим преимуществом данной модели является обеспечение прямого доступа к микроокружению фрагментов костной ткани человека, что позволяет легко наблюдать и анализировать поведение клеток рака молочной железы в ходе краткосрочных экспериментов по совместному культивированию. Этот метод может быть использован для изучения ключевых вопросов о механизмах, лежащих в основе метастазирования рака молочной железы в кости, с целью поиска терапевтических стратегий для эффективного предотвращения и лечения этого процесса. Хотя данная модель позволяет получить представление о метастазировании рака молочной железы, она также может быть использована для изучения других злокачественных новообразований с тропностью к костной ткани, таких как рак предстательной железы.

Фрагменты костной ткани необходимо забирать в разные моменты времени в рамках каждого анализа. Процедура начинается со сбора и транспортировки образца бедренной кости в физиологическом растворе, а затем с подготовки рабочего места в боксе биологической безопасности с использованием хирургических перчаток. Удерживая головку бедренной кости одной рукой, используйте хирургическую пилу для извлечения трабекулярной кости.

Размер фрагментов составляет примерно от двух до пяти миллиметров. Пинцет для этого этапа не подойдет. Вам понадобится качественный хирургический зажим.

Для данного эксперимента подготовьте суспензию клеток рака молочной железы с концентрацией 100 000 клеток на 50 µL DMEM с добавлением 10% FBS. Кроме того, используя обрезанные концы наконечника микропипетки, сформируйте пробку из костного воска для фиксации фрагментов кости и поместите их в чашку Петри. Затем с помощью пинцета перенесите пробки в шестилуночный планшет и, используя стерильную перчатку, прижмите пробки в положении «на 12 часов».

Затем перенесите пипеткой 50 µL клеточной суспензии в центр каждой лунки. Поместите планшет в инкубатор для культур тканей на 45 минут для обеспечения прикрепления клеток. Пока планшет инкубируется, извлеките фрагменты кости с прикрепившимися к ним клетками. Поместите фрагмент костной ткани на костный воск в три лунки и прижмите каждый с помощью GER. Три лунки без фрагментов служат контролем.

Затем медленно добавьте по 5 мл DMEM с 10% FBS на стенку каждой лунки. Следите за тем, чтобы костный воск и фрагменты кости не сместились. После этого инкубируйте культуру в течение 20–24 часов.

На следующий день сначала проведите визуализацию клеток. Добавьте в каждую лунку 300 µg/mL Lucifer, после чего немедленно проведите визуализацию планшета с помощью системы визуализации Ivis. Для этого эксперимента требуется суспензия клеток рака молочной железы, аналогичная той, что использовалась в предыдущем опыте.

После извлечения фрагментов кости с помощью пинцета перенесите каждый фрагмент в отдельную лунку 24-луночного планшета, затем перенесите пипеткой 50 µL клеточной суспензии непосредственно на каждый фрагмент кости и поместите планшет в инкубатор на 45 минут для обеспечения адгезии клеток. После прикрепления клеток осторожно добавьте в каждую лунку от одного до двух миллилитров среды, достаточное количество, чтобы полностью погрузить фрагмент кости. Затем поместите планшет в инкубатор для культур тканей на 20–24 часа.

Для подготовки к визуализации на системе Ivis, флуоресцентной визуализации или сбора клеток костного мозга для анализа с помощью Ivis перенесите фрагменты кости в 24-луночный планшет, добавив в каждую лунку один миллилитр свежей среды. Добавьте в каждую лунку 300 micrograms per milliliter Lucifer и следуйте процедуре, описанной ранее для флуоресцентной микроскопии. Пипетируйте пять microliters раствора для флуоресцентного мечения бисфосфонатом в каждую лунку, чтобы пометить костные спикулы фрагмента кости, и инкубируйте планшет еще в течение 24 часов.

Спустя 24 часа с помощью пинцета перенесите фрагменты на планшеты, содержащие среду без фенолового красного. Затем рассмотрите планшеты с помощью флуоресцентного микроскопа, настроенного на съемку при 485 нанометрах для локализации колонизировавших клеток рака молочной железы, экспрессирующих GFP, и при 680 нанометрах для идентификации меченных бисфосфонатом костных спикул, после чего промойте костномозговой отдел для анализа количества или свойств клеток.

Перенесите фрагмент в сито с размером пор 70 мкм, установленное над пробиркой объемом 50 мл. Затем с помощью шприца объемом 10 мл с иглой 25 G интенсивно промойте фрагмент 10 мл PBS. Центрифугируйте суспензию при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре для осаждения клеток, после чего аспирируйте и удалите супернатант.

Ресуспендируйте осадок клеток костного мозга в PBS или других необходимых растворах для проведения проточной цитометрии или анализов на жизнеспособность. Начните с получения суспензии костной ткани. Поместите фрагменты кости в лунки 12-well планшета.

В лунки планшета внесите по 2,2 миллилитра DMEM с 10% FBS; некоторые лунки оставьте без фрагментов кости в качестве контроля. Инкубируйте планшет в течение 24 часов. Затем удалите среду, замените ее новой и продолжайте культивирование еще 24 часа. Через 48 часов после переноса культур перенесите 0,9 миллилитра супернатанта в приемный планшет, предварительно инкубировав его.

Поместите вставки Transwell в пустой планшет на 24 лунки. Затем перенесите по 100 000 клеток рака молочной железы iPet в 350 µL на каждую вставку. Инкубируйте планшеты в течение 45 минут для обеспечения адгезии клеток. По истечении 45 минут с помощью пинцета перенесите вставки в приемный планшет.

При помещении вставок в приемник обязательно держите их под наклоном. Тщательно вращайте их, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Затем инкубируйте планшет со вставками в течение 20 часов при 37 °C до следующего дня.

С помощью пинцета извлеките вставки и добавьте в каждую по 300 micrograms per milliliter Luciferin. Выполните биолюминесцентную визуализацию приемной пластины для обнаружения клеток рака молочной железы, которые мигрировали через мембраны и прикрепились к дну лунок приемной пластины. Сначала заполните приемную пластину средой и поместите ее в инкубатор для культивирования тканей.

Для засева вставок переверните их в пустом микроцентрифужном кювете с крышкой. Затем нанесите 100 000 клеток в 50 µL на внешнюю нижнюю поверхность мембраны каждой вставки.

Накройте контейнер, оставив крышку приоткрытой, и инкубируйте вставки в течение 45 минут в инкубаторе для культуральных тканей. Затем с помощью пинцета переверните и перенесите вставки в лунки приемной пластины, предварительно добавив в каждую чашку вставки 0,45 milliliters DMEM с 10%FBS. После этого добавьте в каждую вставку фрагмент кости размером три миллиметра или стеклянный шарик и поместите пластину в инкубатор на 20 часов.

На следующий день с помощью пинцета перенесите фрагменты и бусины в планшет с лунками, содержащими один миллилитр свежей среды. Добавьте в каждую лунку 300 micrograms per milliliter Lucifer и приступите к биолюминесцентной визуализации. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Для измерения пролиферации клеток рака молочной железы их культивировали совместно с иммобилизованными фрагментами костной ткани. Биолюминесцентная визуализация через 24 часа культивирования показала усиление пролиферации клеток рака молочной железы в присутствии фрагментов кости в верхних трех лунках по сравнению с их отсутствием в нижних трех лунках. Результаты экспериментов с использованием фрагментов из трех отдельных хирургических образцов продемонстрировали усиление пролиферации в присутствии костной ткани по сравнению с ее отсутствием.

Во всех трех случаях с помощью биолюминесцентной визуализации через 24 часа наблюдалась колонизация клеток MCF seven F Luke EGFP, высаженных непосредственно под фрагменты костной ткани. Снижение сигнала было связано с уменьшением плотности высева через 48 часов. Фрагменты с прямым высевом, маркированные бисфосфонатным реагентом, выявили колонизацию GFP-положительных клеток рака молочной железы в минерализованных отделах и костном мозге.

Миграция клеток рака молочной железы через пористую миграционную мембрану по направлению к культуре ткани кости; в верхних трех лунках наблюдалась интенсивная миграция по сравнению с контролем. В нижних трех лунках видна среда. Также наблюдалась миграция в три фрагмента кости из одного образца тотального эндопротезирования тазобедренного сустава (THR), в то время как миграция на гранулы отсутствовала.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выделять фрагменты ткани кости человека из образца головки бедренной кости и использовать их в анализах совместного культивирования для изучения поведения клеток рака молочной железы, включая миграцию, колонизацию и пролиферацию.