Методы культивирования бедренной кости человека тканевых эксплантов для изучения клеток рака молочной железы колонизации метастатического ниши

Протоколы описаны для изучения миграции клеток рака молочной железы, пролиферации и колонизации в костной ткани системе эксплантов модели человека.

Целью этой процедуры является изучение пролиферации, колонизации и миграции клеток рака молочной железы в модельной системе эксплана костной ткани человека. Это достигается путем выделения фрагментов трабекулярной костной ткани из хирургических образцов головки бедренной кости и культивирования их с клетками рака молочной железы, экспрессирующими люциферазу и зеленый флуоресцентный белок. Биолюминесцентная визуализация используется для измерения пролиферации клеток и проверки колонизации клеток рака молочной железы в фрагментах костной ткани.

Модели колонизации клеток рака молочной железы визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Отделение костного мозга может быть промыто из фрагментов для анализа методом проточной цитометрии, люминесцентного и окрашивающего анализов. Миграция клеток рака молочной железы к культуре тканей, надосадочной жидкости и фрагментам костной ткани измеряется в миграционных камерах Transwell с биолюминесцентной визуализацией Кость является наиболее частым местом метастазирования рака молочной железы, и в конечном итоге эта модель открывает новые возможности для изучения клеток рака молочной железы в метастатической нише кости.

Большим преимуществом этой модели является то, что она обеспечивает прямой доступ к микроокружению фрагментов костной ткани человека, что позволяет легко наблюдать и анализировать поведение клеток рака молочной железы во время краткосрочных экспериментов по совместному культивированию. Этот метод может быть использован для изучения ключевых вопросов о механизмах, лежащих в основе рака молочной железы, метастазов в кости с целью определения терапевтических стратегий для эффективной профилактики и лечения его действия. Хотя эта модель может дать представление о метастазировании рака молочной железы, она также может быть использована для изучения других злокачественных опухолей, ищущих кости, таких как рак предстательной железы.

Фрагменты костной ткани должны быть собраны в различных точках каждого анализа. Это начинается со сбора и транспортировки образца бедренной кости в физиологическом растворе и подготовки рабочего места в шкафу биобезопасности в хирургической перчатке. Возьмитесь за головку бедренной кости одной рукой и с помощью хирургического сырья извлеките трабекулярную кость.

Фрагменты имеют размер от двух до пяти миллиметров. Щипцы не подойдут для этого этапа. Вам нужно качественное хирургическое сырье.

Для этого эксперимента приготовьте суспензию клеток рака молочной железы из 100 000 клеток на 50 микролитров DMEM плюс 10% FBS. Кроме того, подготовьте пробки из костного воска для мобилизации костных отломков с помощью отрезанных концов наконечника микропипетки, храните пробки в чашке Петри. Затем с помощью щипцов перенесите пробки в шестилуночную пластину и с помощью стерильной перчатки прижмите пробки в положение «12 часов».

Далее пипеткой внесите по 50 микролитров клеточной суспензии в центр каждой. Поместите планшет в инкубатор для тканевых культур на 45 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток, пока планшет инкубирует фрагменты кости с прикрепленными к планшету клетками. Поместите фрагмент костной ткани на костный воск в три лунки и придавите каждую с помощью ГЕР трех лунок без фрагментов серверов управления.

Далее медленно добавьте пять миллилитров DMEM плюс 10% FBS в стенку каждой лунки. Костный воск и костные фрагменты не должны смещаться. Затем инкубируйте культуру в течение 20 – 24 часов.

На следующий день сначала визуализируйте клетки. Добавьте 300 микрограммов на миллилитр Lucifer в каждую лунку, а затем сразу же сделайте визуальный образ пластины с помощью платформы визуализации Ivis. Для этого эксперимента требуется суспензия клеток рака молочной железы, как и в предыдущем.

После извлечения костных фрагментов с помощью щипцов перенесите каждый фрагмент в пустую лунку 24-луночного планшета, затем нанесите пипеткой 50 микролитров клеточной суспензии непосредственно на каждый фрагмент кости и перенесите планшет в инкубатор на 45 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток. Как только клетки прикрепятся, аккуратно добавьте в каждую лунку от одного до двух миллилитров среды, чтобы погрузить костный фрагмент. Затем поместите планшет в инкубатор для тканевых культур на 20-24 часа.

При подготовке к визуализации Ivis, флуоресцентной визуализации или сбору клеток костного мозга для анализа для визуализации Ivis перенесите костные фрагменты в 24-луночный планшет с одним миллилитром свежей среды на лунку. Добавьте 300 мкг на миллилитр Люцифера в каждую лунку и действуйте, как описано ранее для флуоресцентной микроскопии. Внесите пипеткой по пять микролитров флуоресцентного раствора для мечения бисфосфата в каждую лунку, чтобы пометить костные спикулы фрагмента кости, и инкубируйте планшет еще 24 часа.

Через 24 часа с помощью щипцов перенесите фрагменты в планшеты, содержащие фенол-красную свободную среду. Затем просмотрите планшеты с помощью флуоресцентного микроскопа, настроенного на получение изображений с точностью до 485 нанометров, чтобы локализовать GFP, экспрессирующий клетки рака молочной железы, и 680 нанометров. Для идентификации меченых бисфосфатом костных спикул промывают компартмент костного мозга для анализа количества или свойств клеток.

Перенесите фрагмент в ситечко 70 микрон над 50-миллилитровой трубкой летописной пробирки. Затем с помощью шприца объемом 10 миллилитров с иглой 25 калибра энергично промывайте фрагмент 10 миллилитров центрифуги PBS. Суспензия при 300 G в течение трех минут при комнатной температуре для гранулирования клеток аспирации и отбрасывания супината реуса.

Сгибайте гранулу клеток костного мозга в PBS или других желаемых растворах для проточной цитометрии или анализа жизнеспособности. Начните с создания костной ткани. Поместите фрагменты костей в лунки 12.

Луночный планшет содержит 2,2 миллилитра DMEM 10% FBS на лунку и оставляет некоторые контрольные лунки без костных отломков. Заквашивайте тарелку в течение 24 часов. Затем аспирируйте и замените среду и продолжайте культивирование еще 24 часа, через 48 часов в культуру перенесите 0,9 миллилитра супината на приемную пластину во время временной инкубации принимающей пластины.

Поместите вкладыши Transwell в пустую 24-луночную пластину. Затем iPet 100 000 клеток рака молочной железы по 350 микролитров на каждую вставку. Затем культивируйте пластины в течение 45 минут, чтобы способствовать прикреплению клеток Через 45 минут используйте щипцы для переноса вкладышей в пластину-приемник.

Обязательно наклоняйте вставки при помещении их в ресивер. Хорошо супинировать, чтобы не образовывались пузырьки. Затем инкубируйте пластину со вставками в течение 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день.

С помощью щипцов удалите вставки и добавьте в каждую из них 300 микрограммов на миллилитр. Хорошо проведите биолюминесцентную визуализацию на реципиентной пластине, чтобы обнаружить клетки рака молочной железы, которые мигрировали через мембраны и прикрепились к дну лунок реципиентной пластины. Сначала загрузите планшет-приемник средой и поместите ее в инкубатор для тканевых культур.

Чтобы засеять вкладыши. Переверните их в пустой коробке из-под микросплавов с крышкой. Затем добавьте 100 000 ячеек по 50 микролитров на наружную нижнюю поверхность каждой вставной мембраны.

Накройте коробку, оставив крышку треснувшей, и инкубируйте вкладыши в течение 45 минут в инкубаторе для культуры тканей. Затем с помощью щипцов перевернуть и перенести вкладыши, лунки приемной пластины в каждую чашку-вкладыш по 0,45 миллилитра DMEM с 10% FBS. Затем добавьте к каждой вставке трехмиллиметровый фрагмент кости или стеклянную бусину и разрежьте на пластине на 20 часов.

На следующий день с помощью щипцов отломки и бусины переложить в тарелку с лунками, содержащими миллилитр свежей среды. Добавьте 300 микрограммов на миллилитр Люцифера на лунку и приступайте к биолюминесцентной визуализации. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Клетки рака молочной железы совместно культивировали рядом с иммобилизованными костными фрагментами для измерения пролиферации клеток молочной железы. Биолюминесцентная визуализация после 24 часов культивирования показала усиление пролиферации клеток рака молочной железы в присутствии костных фрагментов в трех верхних лунках по сравнению с отсутствием костных фрагментов в трех нижних лунках. Результаты экспериментов с использованием фрагментов из трех отдельных хирургических образцов показали усиление пролиферации в присутствии по сравнению с отсутствием кости.

Во всех трех случаях колонизация семи клеток MCF F Luke EGFP, сидящих непосредственно под фрагментами костной ткани, наблюдалась с помощью биолюминесцентной визуализации через 24 часа. Снижение сигнала было связано со снижением плотности посева через 48 часов. Фрагменты с прямым посевом, меченные бисфосфонатным реагентом, выявили колонизацию GFP-положительных клеток рака молочной железы в минерализованном и костном компартментах.

Миграция клеток рака молочной железы через пористую миграционную мембрану к культуре костной ткани, надосадочной жидкости, наблюдаемой в трех верхних лунках, была устойчивой по сравнению с миграцией в контрольную группу. Средний залегает в трех нижних скважинах. Также наблюдалась миграция в три костных фрагмента из данного образца THR, в то время как миграции на бусины не наблюдалось.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как извлекать фрагменты костной ткани человека из образца головки бедренной кости и инициировать их для анализа сокультуры для измерения поведения клеток рака молочной железы, включая миграцию, колонизацию и пролиферацию.