Общая цель следующего эксперимента заключается в применении данной модели покоя in vitro для изучения молекулярных и клеточных механизмов, а также для выдвижения гипотез, которые в дальнейшем будут проверяться на более сложных биологических моделях in vivo. Это достигается путем культивирования эстрогенположительных клеток рака молочной железы в планшетах для культивирования тканей с фибриновым покрытием при конгенной плотности, при которой их взаимодействия происходят преимущественно с субстратом, а не друг с другом. На втором этапе в некоторых эстрогенположительных клетках индуцируется состояние покоя, которое поддерживается с помощью FGF two и фибронектина, что имитирует состояние клеток рака молочной железы в костном мозге.

Затем в систему вносят возмущение путем добавления антител, ингибиторов, пептидов или нуклеиновых кислот, чтобы нарушить различные фенотипические и молекулярные аспекты покоящихся клеток и определить их роль в поддержании состояния покоя. Результаты демонстрируют количество и внешний вид растущих и покоящихся колоний, образовавшихся в результате обработки инкубированных клеток FGF2 на планшетах, покрытых фибронектином. Данный метод позволяет определить, какие сигнальные пути, молекулы адгезии или иные специфические молекулярные механизмы отвечают за развитие и поддержание состояния покоя в эстрогензависимых клетках рака молочной железы, расположенных в микроокружении костного мозга.

Для начала аспирируйте культуральную среду из планшетов, в которых клеточные линии CF seven достигли примерно 50% конфлюэнтности, и промойте их предварительно нагретым PBS. Затем добавьте один миллилитр 0,25% раствора трипсина-ЭДТА, растворенного в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы без добавления эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубируйте планшеты от одного до четырех минут при 37 °C до начала отсоединения клеток.

Как только клетки открепятся от планшета и начнут образовывать суспензию одиночных клеток, разбейте оставшиеся скопления клеток, несколько раз перенося жидкость вверх и вниз с помощью двухмиллилитрового дозатора. Если после четырех минут воздействия трипсина скопления клеток сохраняются, удалите эти клетки и подготовьте новую культуру; клетки, остающиеся прилипшими друг к другу спустя четыре минуты, скорее всего, приведут к ошибке при подсчете количества колоний. Добавьте в трипсинизированные клетки раствор и ресуспендируйте их до концентрации 1 500 cells per milliliter в культуральной среде, используя пятимиллилитровый дозатор для осторожного перемешивания суспензии путем медленного переноса жидкости вверх и вниз. Подсчитайте клетки и с помощью автоматического счетчика клеток убедитесь, что суспензия состоит преимущественно из одиночных клеток.

Это также можно сделать вручную с использованием счетной камеры под фазово-контрастным микроскопом. Затем наберите три миллилитра клеточной суспензии и поочередно распределите по одному миллилитру в две лунки 24-луночного планшета, покрытого фибронектином. Чтобы оптимизировать пространственное распределение клеток, обязательно вносите суспензию пипеткой в центр лунки и не перемещайте планшет до тех пор, пока клетки не осядут и не прикрепятся.

Верните оставшуюся клеточную суспензию в общую смесь клеток и снова перемешайте клетки перед тем, как набрать следующие три миллилитра. Такая процедура позволит снизить вариабельность количества клеток, так как клетки постоянно оседают в пробирке, а работа с пипеткой позволяет быстро распределить большие объемы клеток; при этом пребывание клеток в суспензии при комнатной температуре и концентрации CO2 может повлиять на их конгенный потенциал. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2. Этот этап считается днем минус один.

В графике проведения эксперимента в нулевой день анализа замените среду на один миллилитр свежей среды или свежей среды, содержащей 10 ng/ml фактора роста фибробластов 2. Малое количество клеток в лунке через шесть дней не окажет значительного влияния на состав питательных веществ или цитокинов, а также на pH исходной среды.

На третий день добавьте 100 µL раствора, содержащего 10-кратную конечную концентрацию воздействующего агента, такого как ингибитор PI3-киназы LY 2 9 4 0 0 2, отрицательный контроль LY 3 0 3 5 1 1 или контрольную среду, к одному миллилитру среды, уже находящейся в лунках, и дайте растворам перемешаться путем диффузии. Поместите планшет обратно в инкубатор еще на три дня. На шестой день растворите 0,1% кристаллического фиолетового в растворе 2% этанола и 10 mM борната натрия.

При pH 9 аспирируйте среду из лунок и добавьте один миллилитр раствора кристаллического фиолетового в каждую лунку на 20 минут. Подготовьте станцию промывки, поместив ведро со льдом в раковину и обеспечив непрерывный поток воды в ведро; промойте планшеты, погружая их в воду так, чтобы отверстия лунок были направлены вниз под острым углом к дну ведра. Оказавшись под водой, переведите планшет в горизонтальное положение так, чтобы отверстия лунок были обращены вниз.

Затем снова наклоните планшет под острым углом и одним плавным движением извлеките его. Повторите погружение два или три раза, пока вода на дне лунок не перестанет быть синей. Затем переверните планшеты и положите их на полотенца на лабораторный стол для просушивания в течение ночи.

После высыхания поместите планшет под инвертиционный фазово-контрастный микроскоп и подсчитайте количество растущих и покоящихся колоний в каждой лунке. При 40-кратном увеличении считайте растущими колонии, состоящие более чем из 30 клеток, а покоящимися — колонии, состоящие из 12 или менее клеток. Показано. Здесь представлен типичный вид растущей и покоящейся колоний.

Растущие колонии содержат более 30 клеток, а покоящиеся колонии содержат 12 или менее клеток; последние во много раз крупнее растущих клеток и характеризуются высоким соотношением объема цитоплазмы к ядру при отсутствии добавления FGF2 в культуру. В колониях преимущественно представлены растущие клоны. В то время как в присутствии FGF2 подавляющее большинство клонов находятся в состоянии покоя, с помощью данной системы также можно оценить влияние дополнительных агентов. В данном случае два возмущающих агента в предварительно определенных концентрациях были добавлены в лунки на третий день конгенического анализа.

На рисунке представлена преимущественная ингибиция спящих клонов ингибитором PI3-киназы LY 2 9 4 0 2 при отсутствии эффекта со стороны отрицательного контроля LY 3 0 3 511. Эти эксперименты могут помочь в понимании факторов, определяющих состояние покоя и устойчивость к терапии. Выжившие спящие клетки, подвергшиеся воздействию ингибитора PI3-киназы, утратили распластанную форму, стали мелкими дендритными и приобрели признаки повреждения.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как поставить этот конгенный анализ для выращивания покоящихся клеток, как воздействовать на клетки путем добавления специфических ингибиторов или возмущающих агентов после установления состояния покоя и как количественно оценить эффект этих агентов. Данный анализ может быть использован как для количественной, так и для качественной оценки результатов путем подсчета покоящихся колоний или измерения любого количества ультраструктурных, иммунофенотипических или молекулярных событий в покоящихся и подвергнутых воздействию клетках. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.