Количественное нейрососудистой защите После Серийное гипоксического прекондиционирования и переходных средней мозговой артерии Окклюзия у мышей
4 мая 2015 г.
Этот протокол описывает повторяющееся гипоксическое прекондиционирование или кратковременное воздействие системной гипоксии, которые уменьшают объемы инфаркта и нарушение гематоэнцефалического барьера после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у мышей. В нем также подробно описана двойная количественная оценка объема инфаркта и нарушения гематоэнцефалического барьера после инсульта для оценки эффективности нейроваскулярной защиты.
Общая цель следующего эксперимента заключается в количественной оценке нейропротекции после повторяющегося гипоксического прекондиционирования (RHP) путем одновременного измерения объема инфаркта и целостности гематоэнцефалического барьера. Это достигается путем воздействия на мышей девяти стохастических сеансов гипоксии, различающихся по продолжительности и интенсивности, для обеспечения нейроваскулярной защиты от инсульта. Затем у мыши индуцируют инсульт с последующим введением красителя Эванса.
Эванс синий селективно связывается с альбумином, что позволяет количественно оценить нарушение гематоэнцефалического барьера после умерщвления животного после инъекции. Мозг извлекают и окрашивают TTC для количественного определения объема инфаркта. Результаты демонстрируют нейропротекторный эффект повторного гипоксического прекондиционирования у мышей после ишемического инсульта.
Основное преимущество данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как однократное гипоксическое прекондиционирование, заключается в том, что RHP обеспечивает нейропротекцию у мышей в течение как минимум восьми недель. Этот метод двойного количественного анализа позволяет ответить на ключевые вопросы в исследованиях инсульта, например, как одновременно измерить объемы инфаркта и степень нарушения гематоэнцефалического барьера. Несмотря на то, что данный метод может быть использован для изучения ишемического инсульта, RHP также применим при других системных про-воспалительных состояниях и заболеваниях ЦНС. Для начала разделите мышей на две группы.
Группу RHP, подвергающуюся воздействию 8% и 11% кислорода, и контрольную группу, подвергаемую воздействию 21% кислорода, помещают в камеры, подключенные к соответствующим баллонам с кислородом: для этого с каждой клетки снимают верхнюю крышку-фильтр, после чего клетку вместе с бутылками с едой и водой помещают в камеру. Крышку камеры закрывают и фиксируют. Открывают главный газовый клапан баллонов и устанавливают начальный поток для каждой индукционной камеры на два литра в минуту или LPM.
После пяти минут воздействия снизьте скорость потока до 1 LPM на оставшееся время экспозиции. По окончании воздействия прекратите подачу газа (0 LPM) и закройте газовый клапан. Для баллонов.
Откройте крышки камер и установите на каждую клетку верхнюю крышку с фильтром. Поместите клетки в стандартные условия содержания до следующего сеанса гипоксического воздействия. После каждого использования обрабатывайте каждую индукционную камеру дезинфицирующим средством и дезодорантом с помощью распылителя.
Подвергайте воздействию мышей группы RHP и контрольной группы в одно и то же время суток на протяжении двух недель протокола. Затем проведите транзиторную окклюзию средней мозговой артерии (tMCAO), как описано в тексте. Инъекцию ЭБ следует выполнить через 22 часа после реперфузии; препарат должен циркулировать в кровотоке в течение двух часов перед забоем и окрашиванием NTTC.
Подготовьте объем EB, необходимый для инъекции. Затем наберите требуемое количество раствора комнатной температуры в инсулиновый шприц объемом 0,3 cc. Используя иглу 29-го калибра, зафиксируйте мышь в фиксаторе с плоским дном.
Держите хвост так, чтобы латеральная вена находилась сверху. Латеральные вены расположены по обе стороны от центральной линии хвоста. Зафиксируйте кончик хвоста, чтобы мышь оставалась неподвижной во время инъекции.
Введите иглу в вену примерно на три-пять миллиметров. Осторожно, стараясь не перфорировать вену, введите весь краситель в течение одной минуты. Если раствор поступает в вену, при нажатии на шприц сопротивление должно быть минимальным.
Подтвердите успешное системное внутривенное введение EB по мгновенному изменению цвета тканей хвоста и глаз мыши. Извлеките иглу из хвоста и осторожно прижмите место инъекции чистой марлей, чтобы остановить кровотечение. Запустите таймер.
Когда кожа мыши станет синей, дайте ЭБ циркулировать в течение двух часов для проникновения через ослабленный гематоэнцефалический барьер. Перфузию и окрашивание ТТС следует проводить через 24 часа после реперфузии (через 24 часа после T-M-C-A-O) и через два часа после введения ЭБ; усыпите животное передозировкой изофлурана в небольшой индукционной камере. Перфузию следует начать сразу после умерщвления, чтобы минимизировать автолиз, который начинается в отсутствие кислорода после смерти.
Быстро зафиксируйте животное на пенопластовой платформе, прижав передние конечности за лапы. Сделайте боковой разрез брюшной стенки от срединной линии чуть ниже грудной клетки. Осторожно рассеките диафрагму, чтобы обнажить сердце.
Запустите перфузионный насос со скоростью потока 5 мл/мин, используя шприц объемом 60 см³, заполненный ледяным 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), который подключен к бабочковой игле 27G. Введите кончик иглы примерно на 0,5 см в левый желудочек сердца и сделайте разрез правого предсердия. В процессе перфузии из предсердия должна вытекать венозная кровь с постепенным снижением концентрации, пока она не станет бесцветной. Проведите транскардиальную перфузию сердца 30 мл 0,01 М PBS.
Затем добавьте по 5 мл раствора TTC в 20 прозрачных флаконов для сцинтилляции. Сразу после перфузии обезглавьте животных и извлеките головной мозг с помощью маленьких ножниц и, при необходимости, шпателя. Убедитесь, что полушарие, контрлатеральное окклюзированной средней мозговой артерии, выглядит бледным, без заметной утечки EB или отека.
Затем налейте PBS в акриловую матрицу для мозга, предназначенную для изготовления корональных срезов мозга мыши толщиной 1,0 миллиметра. Поместите мозг в матрицу дорсальной стороной вверх и немедленно залейте его PBS. Поддерживайте мозг во влажном состоянии.
Удалите обонятельные луковицы, вставив лезвие из нержавеющей стали толщиной 0,21 millimeter во второй слот матрицы со стороны рострального конца. Затем удалите мозжечок, вставив лезвие в четвертый слот матрицы со стороны каудального конца. Вставьте лезвие в средний из оставшихся слотов матрицы.
Затем вставьте остальные лезвия, равномерно разделяя оставшуюся ткань, чтобы обеспечить максимально однородное распределение ткани при нарезке. После установки всех лезвий добавьте одну-две капли PBS на мозг для его увлажнения. Затем поочередно извлеките лезвия из матрицы, начиная с ростральной области.
Первые семь срезов оставьте для анализа с TTC. После T-M-C-A-O с помощью небольшого шпателя осторожно перенесите срезы с лезвия в пробирку, наполненную TTC. Когда все срезы окажутся в пробирке, закройте ее крышкой и поместите в водяную баню с теплой водой до тех пор, пока срезы не окрасятся в розовый цвет.
При необходимости осторожно поворачивайте флакон в водяной бане, чтобы избежать перекрытия срезов, что может привести к неравномерному окрашиванию. Затем удалите TTC и налейте во флакон 4% раствор параформальдегида так, чтобы он полностью покрыл срезы мозга. Это остановит химическую реакцию TTC.
Немедленно расположите срезы на чистом предметном стекле размером один на три дюйма, ориентируя их от рострального к каудальному концу. Отсканируйте предметное стекло. При использовании стандартного сканера установите разрешение не менее 600 DPI для последующего анализа изображений.
Обязательно укажите название животного и приложите метрическую линейку при сканировании изображения. В завершение переверните предметное стекло и отсканируйте обратную сторону, чтобы обеспечить сбор всех данных. RHP снижает объем инфаркта на 46% по сравнению с контрольными мышами, однако, согласно данным TTC для тех же животных, не оказывает влияния на отек полушария.
RHP снижает нарушение гематоэнцефалического барьера, определяемое по утечке красителя Evans Blue, нормализованной по контрлатеральному полушарию; представлены репрезентативные окрашивания TTC для группы, получавшей RHP, и контрольной группы, подвергавшейся воздействию 21% кислорода. Для каждой мыши ниже указаны соответствующие объемы инфаркта и степень утечки Evans Blue. Ипсилатеральный означает ишемизированное полушарие мозга, а контрлатеральный — незатронутую сторону мозга.
При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости введения синего красителя Эванса через 22 часа после слияния и обеспечении его циркуляции в течение двух часов до момента жертвования животного после завершения развития процесса. Этот метод открыл исследователям в области доклинического изучения инсульта возможность изучить механизмы эндогенной защиты от инсульта у мышей. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как измерить нейропротекторный эффект RHP посредством двойного количественного определения целостности гематоэнцефалического барьера и объемов инфаркта.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод повторяющегося гипоксического прекондиционирования, который предполагает кратковременное воздействие системной гипоксии для уменьшения объема инфаркта и снижения степени нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера после транзиторной окклюзии средней мозговой артерии у мышей. Целью исследования является количественная оценка нейропротекции путем измерения объема инфаркта и целостности гематоэнцефалического барьера.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Исследования инсульта
- Нейропротекция
Теоретические основы
- Повторяющееся гипоксическое прекондиционирование (RHP) обладает потенциальным нейропротекторным действием.
- Инсульт вызывает значительные повреждения головного мозга, что обуславливает необходимость применения защитных стратегий.
- Целостность гематоэнцефалического барьера имеет решающее значение для здоровья мозга после инсульта.
- Количественная оценка объема инфаркта помогает определить степень повреждения головного мозга.
Цель исследования
- Оценить нейропротекторные свойства RHP у мышей.
- Оценить взаимосвязь между воздействием гипоксии и исходами инсульта.
- Разработать метод двойного количественного определения объема инфаркта и нарушения гематоэнцефалического барьера.
Используемые методы
- Мышей подвергают девяти сеансам стохастической гипоксии различной продолжительности и интенсивности.
- Инсульт индуцируют путем транзиторной окклюзии средней мозговой артерии.
- Для оценки целостности гематоэнцефалического барьера вводят краситель Эванса.
- После жертвования животных мозг окрашивают TTC для количественной оценки объема инфаркта.
Основные результаты
- RHP значительно снижает объем инфаркта у мышей после ишемического инсульта.
- После применения RHP количественно фиксируется снижение нарушения гематоэнцефалического барьера.
- Исследование демонстрирует выраженный нейропротекторный эффект гипоксического прекондиционирования.
- Результаты подтверждают эффективность RHP как защитной стратегии против повреждений при инсульте.
Выводы
- Повторяющееся гипоксическое прекондиционирование представляет собой перспективный подход к нейропротекции.
- Одновременное измерение объема инфаркта и целостности гематоэнцефалического барьера является эффективным методом.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения механизмов, лежащих в основе RHP.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики количественно оценивать эндогенную нейроваскулярную защиту на доклинических моделях инсульта путем одновременного измерения объема инфаркта и степени нарушения гематоэнцефалического барьера. Подход с использованием двойного анализа способствует механистическому снижению рисков при разработке нейропротекторных кандидатов, обеспечивая количественные, транслируемые конечные точки для валидации мишеней и идентификации ведущих соединений. Повторяющееся гипоксическое прекондиционирование (RHP) представляет собой масштабируемый и недорогой метод индуцирования долгосрочной защиты ЦНС, что облегчает сортировку портфеля препаратов и повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем количественного определения уменьшения объема инфаркта в качестве функционального показателя нейропротекции.
- Операционная ценность: обеспечивает снижение биологических рисков за счет стандартизированной оценки целостности гематоэнцефалического барьера наряду с измерением области инфаркта.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выбранной мишени, связывая гипоксическое прекондиционирование с устойчивой нейроваскулярной защитой в течение нескольких недель.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем установления базового уровня нейроваскулярной защиты.
- Количественные показатели: обеспечивает получение двухпараметрических результатов (объем инфаркта с помощью TTC, нарушение ГЭБ с помощью Evans Blue), что позволяет проводить многофакторную оценку соединений.
- Повторное использование платформы: поддерживает масштабируемое применение в моделях системных про-воспалительных заболеваний и заболеваний ЦНС, повышая стандартизацию анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует очаговый ишемический инсульт у мышей, предоставляя релевантную системе заболевания платформу для скрининга нейропротекторов.
- Трансляционная преемственность: Связывает механизмы, выявленные на этапе фундаментальных исследований (эндогенная защита), с доклинической валидацией за счет оценки продолжительности устойчивого эффекта.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: Помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем количественной оценки как структурной (инфаркт), так и функциональной (ГЭБ) нейропротекции.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум процесса разработки — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, что обеспечивает бесшовную передачу задач между группами биологов и фармакологов.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о механизмах эндогенной защиты с помощью количественных показателей нейроваскулярных исходов.
- Скрининг: Предоставляет готовые для анализа модели со стандартизированными, воспроизводимыми показателями объема инфаркта и нарушения ГЭБ для оценки соединений.
- Аналитика: Обеспечивает двойные количественные измерения (объем инфаркта по окраске TTC, экстравазация Evans Blue), что позволяет проводить параллельное сравнение эффектов терапии.
- Трансляционные исследования: Соответствует этапам доклинической валидации за счет демонстрации долгосрочной защиты, поддерживая продвижение исследований на основе биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую доклиническую платформу для изучения инсульта и связанных с ним воспалительных состояний, сокращая затраты на избыточную разработку моделей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишени за счет механистического понимания путей эндогенной защиты.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря протоколу стохастической гипоксии и количественному определению по двум конечным точкам.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних стадиях путем раннего снижения нейроваскулярных рисков.
- Влияние на портфель: Обеспечение приоритетности кандидатов в нейропротекторы с поправкой на риск на основе двойных конечных точек эффективности.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области хирургии на грызунах, систем воздействия гипоксии и методов перфузии.
- Необходимы специализированные приборы, включая гипоксические камеры, лазерную доплеровскую флоуметрию и инструменты для прецизионных инъекций.
- Требуется межгрупповая стандартизация между специалистами по уходу за животными, хирургами и гистологами для обеспечения согласованности при количественной оценке ГЭБ и инфаркта.
- При переносе метода на другие модели заболеваний или виды, помимо взрослых самцов мышей линии Swiss Webster, необходимо учитывать особенности адаптации.
- Практические ограничения включают двухнедельный период предварительной подготовки и терминальный характер конечных анализов, что ограничивает возможность продольного отбора проб.
