Недорогой, масштабируемая Поведенческая Анализ для измерения этанола седации Чувствительность и быстрый толерантности в
15 апреля 2015 г.
Простые анализы для измерения чувствительности к этанолу и быстрой толерантности у дрозофил облегчают использование этого модельного организма для исследования этих важных поведенческих свойств, связанных с этанолом. В данной работе описывается относительно простой, масштабируемый анализ для измерения чувствительности к этанолу и быстрой переносимости у мух.
Общая цель следующего эксперимента заключается в оценке чувствительности плодовых мушек к седации этанолом. Это достигается путем помещения мушек в флаконы и подвергания их воздействию паров этанола. На втором этапе определяется количество седированных мушек в каждом флаконе через определенные промежутки времени до тех пор, пока все мушки не окажутся в состоянии седации.
Затем проводится интерполяция временной точки. Когда 50% мух в каждом флаконе будут находиться в состоянии седации, результаты покажут индекс времени, необходимого для седации дрозофил этанолом; данную процедуру сегодня продемонстрирует Симран Синду, студент моей лаборатории. Для начала эксперимента соберите мух одного пола в группы по 11 особей во флаконы со свежим кормом, используя CO2 в течение не более пяти минут, затем оставьте мух на ночь для восстановления во флаконах с кормом в помещении с контролируемыми условиями окружающей среды.
Приготовьте раствор этанола, разбавив чистый 100% этанол очищенной водой до конечной концентрации 85%. Оставьте раствор на ночь при комнатной температуре. Перед началом анализа подготовьте чистый пустой флакон для проб, который будет служить тестовым флаконом. Подготовьте новую пробку из ацетата целлюлозы, силиконовую заглушку и один миллилитр раствора этанола для каждого флакона с мухами, подлежащих тестированию. Установите температуру в помещении от 20 до 25 °C, а относительную влажность — от 55 до 65%. Поручите другому сотруднику присвоить каждой группе флаконов уникальный код и записать его для последующего использования. Поместите закодированные флаконы с мухами в тестовую комнату на несколько минут для акклиматизации. Затем промаркируйте пустые тестовые флаконы в соответствии с кодами на флаконах с мухами.
Создайте бумажный журнал тестирования, внося коды в столбцы электронной таблицы, где один столбец соответствует одному флакону. Используя журнал тестирования в качестве руководства, расставьте закодированные флаконы с кормом и мухами, а также пустые тестовые флаконы в соответствующие массивы в помещении для тестирования. Поочередно перенесите мух из флаконов с кормом в соответствующие промаркированные тестовые флаконы.
Затем немедленно вставьте пробки из ацетата целлюлозы в проверочные флаконы так, чтобы они находились на расстоянии двух сантиметров от верхнего края флакона. Для оценки в момент времени ноль захватите каждый флакон индивидуально большим и указательным пальцами.
Трижды осторожно постучите по столу, чтобы мухи переместились на дно пробирки. Подождите 30 секунд и подсчитайте количество неподвижных и/или мертвых мух. Запишите число неподвижных и мертвых мух для каждой пробирки в соответствующий момент времени.
Отметка ноль минут в бумажном журнале тестирования. Запустите таймер в момент ноль и немедленно добавьте один миллилитр этанола к ацетату целлюлозы. Перемешивайте круговыми движениями с интервалом в пять секунд для первого набора из четырех пробирок согласно порядку.
Тестирование будет проведено после того, как этанол будет добавлен во все четыре испытательные пробирки в наборе. Вставьте силиконовую пробку в каждую пробирку для герметизации через 1, 2, 3, 4 и 5 минут. Добавьте один миллилитр этанола во второй, третий, четвертый, пятый и шестой наборы из четырех пробирок соответственно.
Продолжайте вставлять силиконовые пробки после добавления этанола в каждую группу из четырех пробирок LS на шестой минуте. Протестируйте первую группу из четырех пробирок, зажав каждую пробирку большим и указательным пальцами и осторожно постучав по ней по столу три раза, чтобы мухи упали на дно пробирки. Подождите 30 секунд, затем подсчитайте и запишите общее количество седированных мух.
Мух следует считать седированными, если они либо стоят на дне флакона, но не передвигаются, либо лежат на спине, с размахиванием крыльями или без него. Обрабатывайте каждый флакон в наборе с пятисекундным интервалом согласно следующему графику: на 7-й, 8-й, 9-й, 10-й и 11-й минутах.
Проведите тестирование второго, третьего, четвертого, пятого и шестого наборов флаконов соответственно, аналогично тому, как это было сделано для первого набора на 12-й минуте. Снова протестируйте первый набор из четырех флаконов, а затем продолжите тестирование второго, третьего, четвертого, пятого и шестого наборов флаконов на 13, 14, 15, 16 и 17 минутах соответственно. Продолжайте тестирование мух до тех пор, пока все они не будут седированы.
Введите общее количество мух в каждом флаконе при проведении контрольного тестирования вручную. Зафиксируйте количество неподвижных или погибших мух в момент времени ноль, вычтя их из общего числа мух. Необработанные данные теста с седацией этанолом были преобразованы в процент активных мух в зависимости от времени.
Чувствительность к седации этанолом на основе первичных данных была количественно определена как время седации 50% особей или ST 50. Это время, необходимое для того, чтобы 50% мух перешли в состояние седации, или площадь под кривой (AUC). Анализ выявил эффекты РНК-интерференции (RNAi) против calnexin 14 D в нервной системе, что снизило чувствительность к этанолу по сравнению с контрольной группой; мутации scab и rouser повысили чувствительность к седации этанолом, а мутация happy hour снизила чувствительность к седации этанолом по сравнению с контролем после освоения методики.
При правильном выполнении данная методика занимает полтора часа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается простой метод анализа для измерения чувствительности к этанолу и скорости развития толерантности у Drosophila. Данный метод облегчает исследование поведения, связанного с воздействием этанола, у этого модельного организма.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая биология
- Модельные организмы
Теоретические основы
- Чувствительность к этанолу является важным поведенческим признаком многих организмов.
- Drosophila служит ценной моделью для изучения воздействия этанола.
- Понимание механизмов развития быстрой толерантности может дать представление о механизмах формирования зависимости.
- Простые методы анализа позволяют повысить доступность и воспроизводимость экспериментов.
Цель исследования
- Оценить чувствительность плодовых мушек к седации этанолом.
- Разработать метод измерения быстрой толерантности к этанолу.
- Внести вклад в понимание поведения Drosophila, связанного с воздействием этанола.
Используемые методы
- Мух помещают в флаконы и подвергают воздействию паров этанола.
- Количество седированных мух подсчитывают через определенные интервалы времени.
- Интерполируют время, необходимое для седации 50% мух.
- Мух собирают группами и дают им восстановиться перед тестированием.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет эффективно измерять чувствительность плодовых мушек к этанолу.
- Результаты показывают, что время, необходимое для седации, варьируется у разных особей.
- При повторном воздействии может наблюдаться быстрое развитие толерантности.
- Метод является масштабируемым и воспроизводимым для дальнейших исследований.
Выводы
- Данный анализ обеспечивает надежный подход к изучению чувствительности к этанолу.
- Результаты могут быть использованы в будущих исследованиях аддикции и толерантности.
- Drosophila остается ключевой моделью для исследований в области поведенческой нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Этот анализ обеспечивает масштабируемую и недорогую поведенческую оценку чувствительности к этанолу и развития быстрой толерантности у Drosophila, что позволяет проводить высокопроизводительный генетический скрининг для снижения рисков при валидации мишеней в исследованиях расстройств, связанных с употреблением алкоголя. Путем количественного определения кинетики седативного ответа данный метод способствует механистическому анализу выявленных генетических мишеней и повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки. Простота и воспроизводимость метода облегчают межфункциональное взаимодействие между специалистами в области генетики, нейробиологии и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, используя вызванную этанолом седацию в качестве функционального показателя генетических манипуляций.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет воспроизводимого количественного определения седативных фенотипов для различных генотипов.
- Прогностическая ценность: позволяет рассчитывать показатели времени седации 50 (ST50) и площади под кривой (AUC) для приоритизации мишеней с устойчивыми поведенческими эффектами.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных, количественно определяемых результатов (процент активных мух с течением времени), подходящих для рабочих процессов скрининга.
- Масштабируемость: разработан для низких затрат и простой настройки, что позволяет проводить крупномасштабный генетический анализ без использования специализированного оборудования.
- Воспроизводимость: не зависит от интенсивности манипуляций с мухами, их пола или добавок в среду, что гарантирует получение надежных данных в разных лабораториях и при работе различных операторов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Позволяет оценивать скорость развития толерантности, которая является ключевым фенотипическим индикатором механизмов аддикции на ранних стадиях.
- Значимость для изучения заболевания: Позволяет фиксировать чувствительность к этанолу, модулируемую генетическими пертурбациями (например, RNAi по calnexin14D, мутациями scab, rouser, happy hour), с четко выраженными направленными эффектами.
- Прогресс с учетом рисков: Обеспечивает многоуровневую оценку мишеней на основе величины и направления сдвигов седативного ответа.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный анализ вписывается в континуум поиска новых лекарственных средств — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, обеспечивая поведенческую валидацию, которая связывает генетические открытия с функциональными результатами в нейрофармакологии.
- Фундаментальная биология: способствует уточнению путей передачи сигналов, связывая генетические манипуляции с измеримыми изменениями кинетики седации этанолом.
- Скрининг: предоставляет количественные, временно-разрешенные данные о седации, позволяющие проводить сравнение между различными генетическими состояниями.
- Аналитика: выводит ST50 и AUC в качестве нормализованных показателей для межгруппового сравнения и отбора перспективных соединений (хитов).
- Трансляционные исследования: обеспечивает связь с доклинической значимостью посредством моделирования быстрой толерантности — поведенческого предшественника зависимости.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую поведенческую платформу для итеративного скрининга генетических и фармакологических модуляторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, обеспечивая прямое, количественно измеримое определение поведенческих изменений, вызванных этанолом.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет нечувствительности к переменным при манипуляциях и контролю условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go), предоставляя четкие фенотипические сигналы в результате генетических возмущений.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию целей с учетом рисков на основе величины и направления эффекта в чувствительности к седации.
Особенности реализации
- Требуются базовые энтомологические или нейроповеденческие навыки для работы с мухами и оценки степени седации.
- Необходимо стандартное лабораторное оборудование: пробирки, пробки, таймеры, раствор этанола и средства контроля условий окружающей среды (20–25°C, 55–65% RH).
- Требуются стандартизированные критерии оценки седированных мух (неподвижность на полу или на спине) для обеспечения согласованности данных.
- Необходимы этапы акклиматизации и кодирования для минимизации ошибки оператора и проведения слепого тестирования.
- Метод ограничен измерением седативного ответа; он не фиксирует локомоторную активацию или сложные мотивационные формы поведения.
