Выбор размера Автоматизированная гель для улучшения качества секвенирования библиотек следующего поколения, полученного из окружающей среды проб воды

В данном видео демонстрируется использование автоматизированного прибора для селекции фрагментов геля по размеру с целью повышения качества прочтений на платформах секвенирования следующего поколения. Сначала собираются пробы природной воды, которые пропускают через серию фильтров для систематического разделения частиц эукариотического, бактериального и вирусного размеров. Удержанные бактерии затем дополнительно концентрируют путем центрифугирования.

Затем проводят экстракцию бактериальной ДНК. Экстрагированную ДНК используют для подготовки библиотек, в которых адаптеры и индексы встраиваются во фрагментированную ДНК. Далее ДНК амплифицируют с помощью ПЦР, после чего образцы загружают в электрофоретическую станцию.

Затем автоматически выбираются фрагменты ДНК в определенном диапазоне. Анализ электрофореграмм, полученных с помощью капиллярного электрофореза на чипе, и дополнительные биоинформатические данные показывают, что данный метод позволяет получить количество фрагментов ДНК, подходящее для последующего анализа, при минимальной кластеризации нежелательных фрагментов размером менее 200 base pairs. Основным преимуществом автоматизированной станции Electrophoresis square, парамагнитных частиц и других коммерческих систем является возможность более точного и узкого диапазона отбора, при этом за один запуск может быть обработано до 96 образцов.

Хотя этот метод позволяет получить представление о микробных сообществах в пробах пресной воды, его можно применять и к другим системам, таким как морская вода, сточные воды, образцы растений, донные отложения или микробные маты — по сути, к любому образцу ДНК, для которого требуется узкий диапазон размеров фрагментов. Идея этого метода возникла у нас, когда мы заметили короткие фрагменты в последовательностях, полученных на платформе MySEQ. Мы перепробовали несколько подходов к селекции по размеру, включая различные типы парамагнитных частиц и их соотношения, а также метод ручного выделения фрагментов из геля.

Затем мы начали сотрудничать с Coastal Genomics, частной корпорацией из Британской Колумбии, предлагающей технологию Ranger. Демонстрировать процедуру сегодня будут Майкл Чан, лаборант-исследователь из моей лаборатории, Мигель И, постдок из моей лаборатории, и Джаред Слоан, инженер из Coastal Genomics. В этом видео мы опишем только очистку и анализ материала, собранного на фильтрах 0.2 micron, прежде всего свободноживущих бактерий, но имейте в виду, что аналогичные подходы могут быть использованы и для других частиц, извлеченных из фильтров.

Начните выполнение данной процедуры со сбора 40 литров проб пресной воды из нескольких природных объектов в стерильные 20-литровые канистры. Проведите предварительную фильтрацию проб на месте (in situ), используя полипропиленовый фильтр со спектральной сеткой с размером ячеек 105 микрометров. В данном случае пробы отбираются из водосборов городских и сельскохозяйственных территорий.

После сбора поместите образцы в охладители и транспортируйте их обратно в лабораторию. Храните образцы при температуре four degrees Celsius. На следующий день.

Установите систему фильтрации, состоящую из бутыли для сбора образцов, соединенной с помощью перистальтического насоса с одномикронной капсулой для отбора проб Enviro Check. Подключите капсулу для отбора проб к дисковому фильтру с порами 0.2 micron, а его — к тангенциальному фильтру с порогом отсечения 30 kilodalton с помощью второго перистальтического насоса. Включите перистальтические насосы для пропускания образцов через серию фильтров; эукариотические клетки будут изолированы при прохождении через капсулу для отбора проб.

Бактериальная фракция будет выделена на мембранном дисковом фильтре, а вирусные частицы — на фильтре для тангенциальной поточной фильтрации. Извлеките мембранный фильтр или фильтры с порами 0.2 µm из системы фильтрации воды. Затем сложите фильтр пополам и поместите его в пробирку объемом 50 mL.

Расположите пробирку открытой стороной вверх. Добавьте в пробирку 5 mL PBS с tween. Если в процессе фильтрации использовалось более одного фильтра, используйте отдельную пробирку для каждого фильтра.

Затем фильтры можно хранить при температуре 4 °C или сразу подвергнуть следующей обработке. Далее с помощью стерильного пинцета извлеките мембранный фильтр из пробирки объемом 50 мл и поместите его в чашку Петри, используя стерильный пинцет и стерильные ножницы. Разрежьте фильтр на фрагменты размером 1 см на 1 см между образцами.

Продезинфицируйте инструменты, погрузив их в 70% изопропанол, протерев средством для деконтаминации поверхностей от ДНК, а затем промыв ультрачистой водой первого типа. Поместите фрагменты фильтра обратно в ту же пробирку объемом 50 мл. С помощью стерильного пинцета добавьте 10 мл PBS с tween, чтобы довести общий объем буфера до 15 мл.

Добавьте шесть чистых вольфрамовых шариков диаметром 3 мм в каждую пробирку объемом 50 мл. Закройте пробирку парафильмом и подвергните интенсивному перемешиванию на вортексе в течение 20 минут.

После перемешивания на вортексе объедините все суспензии в одну чистую пробирку объемом 50 миллилитров для каждого образца. Центрифугируйте пробирки при 3 300 GS в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте осадок.

Распределите бактериальные клетки, суспендированные в 5 мл раствора PBS, по аликвотам объемом 1 мл в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл и центрифугируйте в микроцентрифуге при 10 000 ×g в течение 10 минут. После центрифугирования с помощью пипетки удалите супернатант, оставив 200 µL. Храните образцы при -80 °C или приступайте к выделению бактериальной ДНК с использованием имеющегося в продаже набора для выделения ДНК.

При экстракции бактериальной ДНК используйте PBS или воду в качестве отрицательного контроля экстракции и E. coli в качестве положительного контроля экстракции. После завершения процедуры экстракции ДНК объедините аликвоты из одного и того же образца в одной пробирке объемом 2 мл с 10 мМ Трис-буфером. Затем проведите осаждение в течение ночи, добавив раствор, состоящий из 10% 3 М ацетата натрия, два объема 100% этанола и 5 µL линейного акриламида. Храните образцы при температуре -80 °C.

На следующий день центрифугируйте образцы при 17, 000 GS в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования промойте осадок одним миллилитром ледяного 70% ethanol; дайте осадку высохнуть на воздухе в боксе биологической безопасности не более пяти минут.

Затем ресуспендируйте осадок ДНК в 10 мМ Tris-HCl. В завершение определите количество и качество ДНК, проведя высокочувствительный флуоресцентный анализ количественного определения нуклеиновых кислот с последующей микрообъемной спектрометрией. После определения количества ДНК в каждом образце добавьте в каждую пробирку соответствующий объем воды, чтобы довести концентрацию примерно до 0,2 нг/мкл.

Используя имеющийся в продаже набор, подготовьте библиотеку ДНК из индексированных фрагментов из одного нанограмма бактериальной ДНК. В данном случае применяется метод на основе транспозазы, известный как тагментация, для одновременной фрагментации ДНК и включения в нее последовательностей адаптеров. Затем проводится ПЦР для одновременной амплификации и индексации образцов, что позволяет добавить специфические штрих-коды к каждому фрагменту и обеспечить наличие последовательностей, необходимых для формирования кластеров, которые могут быть считаны платформой секвенирования.

После завершения ПЦР пропустите стандартный этап очистки после ПЦР и добавьте по 3,5 µL загрузочного буфера в каждый образец, чтобы общий объем составил 28,5 µL. Затем перенесите образцы в 96-луночный планшет. Установите 96-луночный планшет в электрофорезную станцию с предварительно отлитой кассетой с 1,5% агарозой, используя пользовательский интерфейс программного обеспечения Ranger.

Установите целевой диапазон размеров фрагментов от 500 до 800 пар оснований. Установите объем экстракции 300 µL. Запустите процесс.

Электрофоретическая станция автоматически загружает образцы в кассеты aros. Затем на кассеты подается напряжение, а установленная на портале система визуализации используется для определения местоположения ДНК образца в aros на протяжении всего цикла анализа.

Программное обеспечение Ranger захватывает изображения и с помощью внутренних стандартов оценивает положение целевого объекта выбранного размера в каждом образце. После идентификации целевых объектов программа Ranger изменяет напряжение, подаваемое на каждый образец, чтобы синхронизировать время прибытия целевых объектов в экстракционные лунки кассеты.

Наконец, рабочая станция для электрофореза аспирирует целевые образцы в TBE из лунок для экстракции и дозирует их в новый 96-луночный планшет для концентрирования исходного материала, после чего проводят осаждение объема элюата с использованием ацетата натрия, этанола и линейного акриламида в течение ночи при -80 °C. Снова центрифугируют образцы при 17 000 ×g в течение 30 минут. После центрифугирования супернатанты удаляют, а затем промывают планшет с ДНК одним миллилитром ледяного 70% этанола с последующим центрифугированием.

Центрифугируйте образцы при 17 000 g в течение 30 минут, слейте супернатант, высушите их и, наконец, ресуспендируйте осадок ДНК в 10 мМ Tris-CL. Затем проведите нормализацию образцов с помощью бусин для нормализации библиотек, которые входят в комплект для подготовки библиотек transpose on base. В завершение выполните секвенирование ДНК на платформе секвенирования следующего поколения (NGS), чтобы получить более информативные риды, повысив тем самым качество секвенирующих библиотек.

Пробы воды были отобраны в восьми различных точках водосбора, и из выделенной бактериальной фракции были подготовлены индексные библиотеки ДНК, как показано на данной электрофореграмме. Библиотеки ДНК, полученные из проб пресной воды после ПЦР, но до автоматизированного отбора по размеру, состояли из фрагментов размером от 50 до 3000 пар оснований. После отбора по размеру с использованием высокопроизводительной автоматизированной платформы образцы содержали узкий диапазон фрагментов ДНК от 500 до 800 пар оснований. Таким образом, использование данной платформы для автоматизированного гель-отбора по размеру позволило получить подходящий выход и минимизировать кластеризацию нежелательных фрагментов размером менее 200 пар оснований.

Секвенирование ДНК данной библиотеки на системе MiSeq с алюминиевым картриджем обеспечило плотность кластеров 1198 K на квадратный миллиметр. Процент кластеров, прошедших фильтрацию, составил 84.2% при расчетном выходе данных 9.2 гигабайт. Кроме того, 7.4 гигабайта, или 82.8% чтений, имели показатель качества больше или равен 30.

Это означает, что примерно 83% оснований, секвенированных с помощью данного модифицированного протокола, примененного к пробам природной воды, имели точность определения оснований не менее 99,9%. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как обеспечить получение более информативных данных из библиотек секвенирования. При выполнении данной процедуры важно учитывать целевую микробную фракцию, что влияет на выбор метода подготовки библиотек, целевую длину фрагмента и платформы секвенирования.