Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Общая цель данной процедуры заключается в проведении полуавтоматического трехмерного микропланшетного анализа инвазии опухолевых клеток in vitro. Это достигается путем первоначального создания воспроизводимых по размеру опухолевых сфероидов в суспензии в 96-луночных планшетах с круглым дном и ультранизкой адгезией, по одному сфероиду в каждой лунке. На втором этапе удаляют часть среды и добавляют в каждую лунку матрикс, имитирующий базальную мембрану (BMM), для создания полутвердой матрицы, в которую опухолевые клетки будут мигрировать из тела сфероида.

Затем мониторинг инвазии опухолевого сфероида проводится с определенными интервалами в течение 72–96 часов, в течение которых сбор изображений осуществляется либо автоматически на цитометре, либо вручную с помощью микроскопа. Заключительным этапом является анализ инвазии опухолевых клеток с использованием автоматизированного цитометра или программного обеспечения для анализа изображений. В конечном счете, метод 3D-анализа инвазии опухолевых сфероидов используется для моделирования инвазии рака in vitro в формате, который является более физиологически релевантным и подходящим для валидации мишеней и исследований по скринингу лекарственных препаратов.

Мы полагаем, что данный метод дополняет простые двухмерные тесты на пролиферацию клеток, которые обычно используются для валидации мишеней и скрининга лекарственных препаратов в исследованиях рака, поскольку он также позволяет изучать инвазию — ключевой аспект прогрессирования рака — в физиологически релевантном трехмерном формате. Идея этого метода возникла у меня при оптимизации 3D-модели опухоли, растущей на микропланшете. Я подумал, что было бы полезно использовать ту же установку, чтобы изучить также и инвазию; в итоге решение оказалось простым: достаточно было удалить часть среды из каждой лунки и заменить ее матриксом, имитирующим базальную мембрану.

Визуальная демонстрация этого метода крайне важна, так как на начальном этапе может быть сложно удерживать стероиды в центре каждой лунки после переноса BMM. Это может привести к субоптимальному анализу изображений из-за того, что стероиды окажутся в разных фокальных плоскостях. С опытом.

Это происходит редко, но при необходимости процесс можно облегчить осторожным центрифугированием планшета. Чтобы начать подготовку всех BMM на льду в течение ночи, подготовьте набор стерильных фильтрующих наконечников для пипеток P 10 E 200 и P 1000, а также стерильные пробирки при температуре minus 20 degrees Celsius. Также поместите на лед 96-луночные планшеты с ультранизкой адгезией, содержащие четырехдневные стероиды.

С помощью многоканального дозатора аккуратно удалите по 100 µL среды для культивирования из каждой лунки планшетов со стрижей. На этом этапе наклоните наконечник к внутренней стенке U-образной лунки. Старайтесь избегать контакта с дном лунки и местом расположения сфер.

Для минимизации воздействия на стероиды перенесите BMM в охлажденные на льду пробирки, используя наконечники, охлажденные на льду. Для исследований инвазии, индуцированной цитокинами, или для оценки действия препаратов добавляйте реагенты к BMM с помощью наконечников, охлажденных на льду. Например, используйте эпидермальный фактор роста или EGF для стимуляции инвазии клеток плоскоклеточного рака Cal S и cal r.

Затем осторожно внесите 100 µL BMM в лунку, направляя кончик дозатора к внутренней стенке лунки. Этот этап является наиболее критическим.

Что касается анализа оптических изображений, стероиды должны оставаться в центре лунки. Повторите этот шаг для всех необходимых лунок, обеспечив пять-шесть повторностей для каждого условия. При необходимости замените наконечник на новый охлажденный, используя стерильную иглу.

Удалите пузырьки воздуха, если они присутствуют. С помощью микроскопа визуально проверьте, находятся ли стероиды в центре; если нет, центрифугируйте планшет при 300 ×g в течение трех минут при температуре 4 °C. Это обеспечит центральное расположение стероидов в каждой лунке.

Затем перенесите планшет в инкубатор при 37 °C и дайте BMM затвердеть через один час. С помощью многоканального дозатора осторожно внесите в каждую лунку по 100 µL среды для роста, среды для индукции инвазии цитокинами или растворов для исследования действия препаратов.

Добавьте цитокины или ингибиторы в среду для автоматизированного получения изображений. Сканируйте планшеты на цитометре с определенными интервалами. Начиная с нулевого момента времени, выберите приложение для анализа конфлюэнтности.

Затем проверьте, находится ли стероид в фокусе. При необходимости отрегулируйте фокус вручную и зафиксируйте смещение фокуса в настройках сканирования.

Селектор сканирует одно центральное поле зрения. После добавления BMM опухолевые сфероиды должны остаться в центральном положении. Таким образом, нет необходимости сканировать всю лунку в программном обеспечении.

Определите лунки для сканирования, выделив их на карте планшета. Затем нажмите «Начать сканирование» (start scan). Для автоматизированного анализа изображений выберите приложение для определения степени конфлюэнтности (confluence application).

На вкладке анализа настройте параметры приложения для получения точного сегментирования вокруг стероида, включая клеточные отростки и пододии инвазии, проникающие в BMM. Отрегулируйте настройки для каждой линии опухолевых клеток и/или для различных временных точек. Убедитесь, что параметры анализа подходят для других стероидов на планшете, переключившись на несколько разных лунок.

Если сегментация неточно очерчивает стероид, дополнительно настройте параметры приложения. На вкладке с результатами нажмите «start analysis». Перед экспортом данных по лункам в программу для работы с электронными таблицами проверьте несколько лунок, чтобы подтвердить качество анализа.

Повторите анализ для всех временных точек, затем рассчитайте средний процент конфлюэнтности для параллельных лунок и постройте столбчатую диаграмму зависимости инвазии от времени. Используя подходящее научное программное обеспечение для построения графиков и статистического анализа, а также для ручного получения изображений, используйте инвертированный микроскоп, оснащенный объективом 10 x, для записи изображения каждого туморосфероида через определенные интервалы. Начиная с T = 0, в промежутке от T = 72 до 96 часов.

В зависимости от скорости инвазии в исследуемый клеточный слой, используйте объектив Forex, если область инвазии слишком велика, чтобы полностью попасть в поле зрения при 10-кратном увеличении. Сохраняйте каждое полученное отдельное изображение для последующего ручного анализа. Загрузите полученные изображения в программу для анализа изображений.

Для калибровки используется программное обеспечение для анализа изображений предметного микрометра. Используйте объективы с увеличением 10x и 4x. Введите значения графических измерений, единицы измерения и используемые объективы, после чего выполните калибровку.

Данный этап требуется выполнить only один раз для последующего анализа изображений. Просто загрузите необходимые параметры калибровки. Затем откройте изображения теста на инвазию и выберите параметры калибровки в зависимости от объектива микроскопа, использованного для получения снимков.

С помощью используемого здесь программного обеспечения измерьте площадь, занимаемую стероидами. Перейдите в раздел measure и выберите count size. Выберите while, затем загрузите настройки, выбрав предварительно определенные параметры анализа (predetermined assay settings).

Затем выберите параметр count (подсчет). Стериоид должен быть точно сегментирован. Экспортируйте полученные измерения различных параметров в электронную таблицу и запишите в ней соответствующую информацию об изображении.

Наконец, с помощью специализированного программного обеспечения для построения научных графиков и статистического анализа постройте график зависимости среднего значения площади повторностей стероидов или инвазии от времени. В качестве примера здесь представлена инвазия раковых клеток, наблюдаемая в клеточной линии глиобластомы U 87 MG, которая может служить моделью инвазии опухоли головного мозга. После внедрения в BMM клетки распространяются с типичным звездчатым паттерном инвазии; данный процесс отслеживается в течение 72 часов.

Полностью автоматизированный анализ изображений. Использование имидж-цитометра позволяет выполнить сегментацию выступов клеток и обеспечить точную количественную оценку инвазии опухолевых клеток. Обратите внимание, что для данной клеточной линии стероидное тело исключается из измерения площади инвазии.

Полностью автоматизированный анализ изображений легко выполняется и позволяет количественно оценить инвазию опухолевых клеток с течением времени. Различный характер инвазии клеток демонстрируют изогенные линии плоскоклеточного рака головы и шеи человека. Линия раковых клеток Cal S чувствительна к ингибиторам тирозинкиназы EGFR, а линия CAL R устойчива к ним.

В отсутствие EGF ни одна из клеточных линий не проникала в BMM; в присутствии EGF наблюдались пальцевидные выступы, исходящие из основного тела Cal ars стероидов. Хотя клетки Cal s проявляли меньшую инвазивную активность через 72 часа, изображения в данном случае были получены быстро с помощью имидж-цитометра, и для демонстрации альтернативного метода степень инвазии была определена количественно вручную с использованием автономного программного обеспечения для анализа изображений. При выполнении данной процедуры важно помнить, что для каждой клеточной линии необходимо оптимизировать способность к формированию стероидов, плотность посева клеток, состав матрикса, а также параметры получения и анализа изображений. После этой процедуры тот же метод может быть адаптирован для оценки инвазии в 3D-ткань, используя, например, опухоли в совместном культивировании с эмбриональными тельцами для имитации сложной ткани или другие органоиды, такие как астроциты для глиомы, культуры крипт для рака желудочно-кишечного тракта или печень для гепатоцеллюлярной карциномы и метастазов рака толстой кишки.