Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить in vitro, полуавтоматизированный, трехмерный микропланшетный анализ инвазии опухолевых клеток. Это достигается путем предварительного получения опухолевых стероидов воспроизводимого размера в суспензии в сверхнизком присоединении вокруг дна 96, лунок с одновременными стероидами в каждой лунке. Второй шаг заключается в удалении частей среды и добавлении базальной мембраны, такой как матрица или BMM, непосредственно в каждую лунку, чтобы получить полутвердую матрицу, в которую опухолевые клетки проникают из стероидного тела.

Затем инвазия опухолевых стероидов контролируется с интервалами в период от 72 до 96 часов, в течение которых получение изображения выполняется либо автоматически на цитометре, либо вручную на микроскопе. Последним шагом является анализ инвазии опухолевых клеток с помощью автоматизированного цитометра или программного обеспечения для визуализации. В конечном счете, 3D-анализ инвазии опухолевых стероидов используется для моделирования инвазии рака in vitro в формате, который является более физиологически релевантным и поддается целевым исследованиям по валидации и скринингу лекарств.

Мы считаем, что этот метод дополняет простые двумерные анализы пролиферации клеток, обычно используемые для валидации мишеней и скрининга лекарств в исследованиях рака, поскольку он также позволяет нам исследовать инвазию, которая является ключевым аспектом прогрессирования рака в физиологически значимом трехмерном формате. Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я оптимизировал 3D опухоль phe, рост на микропланшете. Я подумал, что было бы хорошо использовать ту же установку и взгляд на инвазию, и в результате было легко просто удалить часть среды из каждой скважины и заменить ее матрицей, аналогичной базальной мембране.

Визуальная демонстрация этого метода имеет важное значение, так как удержание стероидов в центральном положении каждой скважины после традиции BMM может быть затруднительным на начальном этапе. Это может привести к неоптимальному анализу изображений из-за того, что стероиды находятся в разных фокальных плоскостях. С опытом.

Такое случается редко, но при необходимости процесс можно облегчить за счет щадящего центрифугирования пластины. Чтобы начать все BMM на ICE на ночь, держите набор стерильных фильтрующих наконечников для пипеток P 10 E 200 и P 1000 и стерильных пробирок при температуре минус 20 градусов Цельсия. Также поместите сверхнизкую насадку 96 луночных планшетов, содержащих стероиды четырехдневной давности, на лед.

С помощью многоканальной пипетки аккуратно снимите с воробьиных пластинок 100 микролитров питательной среды на лунку. Для этого шага наклоните кончик к внутренней стенке U-образного дна. Хорошо избегая контакта со дном колодца и местом расположения сфэ

Чтобы свести к минимуму нарушение работы стероидов с помощью ледяных наконечников, перенесите BMM в ледяные трубки. Для инвазии, вызванной цитокинами, или для исследований по оценке лекарственных препаратов добавляйте реагенты в BMM с помощью ледяных наконечников. Например, используйте эпидермальный фактор роста или EGF для стимуляции инвазии клеток плоскоклеточной карциномы Cal S и cal r.

Затем аккуратно внесите 100 микролитров BMM в убо. Хорошо направляем наконечник в сторону внутренней стенки колодца. Этот шаг является самым ответственным.

Что касается оптического анализа изображения, то стероиды должны оставаться в центре колодца. Повторите этот шаг для всех необходимых скважин, допустив пять-шесть повторений в каждом условии. При необходимости смените на свежеохлажденный кончик с помощью стерильной иглы.

Удалите пузырьки, если они есть. Используйте микроскоп для визуальной проверки стероидов в центральном положении, если они не центрифугируют пластину при 300 перегрузках в течение трех минут при четырех градусах Цельсия. Это обеспечит центральное расположение стероидов в каждой лунке.

Затем перенесите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и дайте BMM затвердеть через час. С помощью многоканальной пипетки аккуратно добавьте 100 микролитров на лунку полного роста. Индуцированная средой или цитокинами инвазия или исследования по оценке лекарственных средств.

Включите в среду цитокины или ингибиторы для автоматического получения изображений. Сканируйте планшеты на цитометре через определенные промежутки времени. Начиная с нулевого времени, выберите приложение confluence.

Затем проверьте, что стероид находится в фокусе. При необходимости отрегулируйте фокус вручную и зафиксируйте смещение фокуса. В разделе настройки выборки.

Селектор сканирует одно центральное поле зрения. После добавления ВММ опухолевые стероиды должны были оставаться в центральном положении. Таким образом, нет необходимости сканировать всю лунку в программном обеспечении.

Определите скважины для сканирования, выделив их на карте пластин. Затем нажмите на кнопку «Начать сканирование». Для автоматического анализа изображений выберите приложение confluence.

На вкладке анализа отрегулируйте параметры приложения для точной сегментации вокруг стероида, включая клеточные процессы и захватчики, распространяющиеся на BMM. Отрегулируйте настройки для каждой линии опухолевых клеток и/или в различные моменты времени. Убедитесь, что настройки анализа подходят для других стероидов в пластине, щелкнув по нескольким разным лункам.

Если в сегментации не совсем точно очерчен стероид, отрегулируйте настройки приложения дальше. Нажмите на кнопку «Начать анализ» на вкладке результатов. Проверьте несколько скважин для проверки качества анализа перед экспортом данных уровня скважины в программу для работы с электронными таблицами.

Повторите анализ для всех временных точек, затем рассчитайте средний процент слияния для повторяющихся скважин и плюс зависимость вторжения от времени на линейчатой диаграмме. Используя научное графическое и статистическое программное обеспечение для ручного получения изображений, используйте инвертированный микроскоп, оснащенный 10-кратным объективом, для записи изображения для каждого опухолевого стероида через определенные промежутки времени. Начиная с T равно нулю, после T равно от 72 до 96 часов.

В зависимости от скорости вторжения в рассматриваемую оболочку клетки, используйте объектив Forex, когда захваченная область слишком велика, чтобы ее можно было полностью захватить в пределах 10-кратного поля зрения. Сохраняйте каждое отдельное полученное изображение для ручного анализа изображений. Откройте изображения сценического графа для анализа изображений.

Программным обеспечением для калибровки является получение изображений сценического графика. Используя как 10, так и четыре объектива. Введите графические измерения, используемые единицы измерения и объективы, а затем выполните калибровку.

Этот шаг требуется только один раз для последующего анализа изображения. Просто перезагрузите необходимые настройки калибровки. Затем откройте изображения анализа инвазии и выберите настройки калибровки в зависимости от объектива микроскопа, используемого для получения изображений.

Измерьте площадь, покрытую стероидами, в программном обеспечении, используемом здесь. Перейдите к измерению и выберите размер счетчика. Выберите while, затем загрузите настройки и выберите предопределенные настройки анализа.

Затем выберите count. Затем стероид должен быть точно сегментирован. Экспорт измерений – это различные параметры в электронную таблицу и запись соответствующей информации об изображении в электронную таблицу.

Наконец, постройте график зависимости средней площади репликации стероидов или инвазии во времени, используя научные графики и статистическое программное обеспечение. Показано здесь в качестве примера инвазии раковых клеток, наблюдаемой в клеточной линии глиобластомы U 87 MG, которая может быть использована для иллюстрации инвазии опухоли головного мозга. После встраивания в BMM-клетки, распространяющиеся по типичной схеме вторжения звездообразования, этот процесс отслеживается в течение 72 часов.

Полностью автоматизированный анализ изображений. Использование цитометра с помощью изображения производит сегментацию вокруг выпячивания клеток и позволяет точно количественно оценить инвазию опухолевых клеток. Отметим, что для этой клеточной линии стероидное тело исключается из измерения инвазированной области.

Полностью автоматизированный анализ изображений легко выполняется и обеспечивает количественную оценку инвазии опухолевых клеток с течением времени. Иная картина клеточной инвазии проявляется у плоскоклеточного, головного и шейного изогенов человека. Линии раковых клеток Cal S чувствительны, а CAL R устойчив к ингибиторам тирозинкиназы EG FFR.

В отсутствие EGF ни одна из клеточных линий не инвазировала в BMM в присутствии пальцевидных выступов EGF, выдавленных из основного тела стероидов Cal ars. В то время как клетки Cal s были менее инвазивными через 72 часа, изображения в этом случае были получены быстро с помощью цитометра изображения, и чтобы проиллюстрировать альтернативный метод, степень инвазии была количественно определена вручную с помощью автономного программного обеспечения для анализа изображений. плотность посева клеток, состав матрицы, а также настройки изображения и анализа После этой процедуры. Тот же метод, который также может быть адаптирован для оценки 3D-инвазии в ткани с использованием, например, опухолей в кокультуре с телами эмбрионов, чтобы они напоминали сложную ткань, или других органоидов, таких как астроциты для глиомы или культуры крипты для рака желудочно-кишечного тракта, или печень для метастазирования гепатоцеллюлярной карциномы и рака толстой кишки.