Упрощенный нейтрофилов человека Внеклеточные Ловушки (НРТ) Изоляция и регулировать

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы продемонстрировать простой протокол выделения нейтрофилов, внеклеточных ловушек или сеток из цельной крови человека с использованием легкодоступных реагентов. Это достигается путем выделения нейтрофилов из цельной крови человека с использованием метода дифференциального центрифугирования в качестве второго этапа. Изолированные нейтрофилы стимулируют с помощью PMA, чтобы вызвать образование сетки, также называемое NETosis.

Затем готовят планшет с бесклеточным изолятом сетки и добавляют раковые клетки, чтобы продемонстрировать, как сетки влияют на адгезию клеток. Результаты показывают, что добавление монослоя сетки улучшает адгезию 549 раковых клеток и что эта адгезия уменьшается при разрушении сеток. Использование DNAS одной из визуальных демонстраций этого метода имеет решающее значение.

Учитывая новизну данной методики, работа с нейтрофильными ксорными ловушками представляет собой сети крайне затруднительна из-за того, насколько хрупкими являются эти структуры. Для начала получите 80 миллилитров свежей человеческой цельной крови в 14 гепаринизированных пробирках с зеленым верхом, как описано в текстовом протоколе. Откройте каждую пробирку и добавьте в каждую пробирку по пять миллилитров PBS без кальция и магния.

Затем добавьте по 15 миллилитров среды для разделения лимфоцитов или LSM в каждую из четырех 50-миллилитровых конических пробирок комнатной температуры. Затем с помощью иглы 18 калибра, установленной на шприце объемом 60 миллилитров, аккуратно наложите разбавленную кровь на LSM, создав острый интерфейс LSM для крови, центрифугируйте пробирки при 800 умноженных на G в течение 30 минут при 21 градусе Цельсия, не ломая, чтобы остановить центрифугу, осторожно отсадить и отбросить два верхних слоя жидкости и границу раздела между ними, оставив только нижний красный слой. Эта гранула содержит эритроциты и нейтрофилы.

Добавьте в каждую пробирку по 20 миллилитров PBS и по 20 миллилитров 6%-ного раствора декстрана. Аккуратно переверните каждую трубку и дайте им постоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Эритроциты оседают на дно пробирки.

Далее переложите надосадочную жидкость в свежие пробирки и выбросьте поддоны. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 450-кратном перегрузке при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость, оставив богатую нейтрофилами гранулу. Приготовьте лизирующий раствор с 0,5 миллилитров буфера для лизиса в 4,5 миллилитрах стерильной воды.

Добавьте в общей сложности пять миллилитров лизирующего раствора в каждую пробирку и соберите все гранулы в одну колбу. Поместите колбу в темноту на 10 минут при комнатной температуре, чтобы удалить оставшихся эритроцитов. Центрифугируйте нейтрофилы при 450-кратной G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу пятью миллилитрами PBS без кальция и магния. Затем снова центрифугируют образец при 450-кратном G при четырех градусах Цельсия и удаляют надосадочную жидкость, содержащую оставшийся раствор лизиса. Суспендируйте гранулу нейтрофила в 30 миллилитрах холодной среды RPMI с добавлением 3%-ной фетальной бычьей сыворотки и положите трубку на лед для стимуляции образования нейтрофильных внеклеточных ловушек или сеток.

Добавьте 500 наномоляров PMA к 30 литрам суспензии нейтрофилов в плоской чашке для культивирования тканей размером 150 на 25 миллиметров. С помощью 20-миллиметровой сетки инкубируйте клетки в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия под 5% углекислого газа. После инкубации аккуратно аспирируйте и выбросьте среду, стараясь не нарушить слой сеток и нейтрофилов, прилипших к дну посуды.

Затем с помощью пипетки промыть дно каждой посуды 15 миллилитрами холодного ПБС без кальция и магния, весь прилипший материал следует удалить со дна. Соберите промывочную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, а затем центрифугируйте при 450-кратном G в течение 10 минут. При четырех градусах Цельсия нейтрофилы и любые оставшиеся клетки будут окапываться на дне.

Оставляя бесклеточную чистую богатую надосадочную жидкость, затем сцеживайте надосадочную жидкость в несколько пробирок по 1,5 миллилитров и центрифугируйте при 8 18 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Для гранулирования ДНК отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют гранулу в PBS таким образом, чтобы концентрация соответствовала двум умноженным на 10 до седьмого нейтрофила на 100 микролитров PBS. Этот бесклеточный сетчатый запас может быть использован для последующих экспериментов.

Измерьте концентрацию ДНК образца с помощью спектрофотометрии. Адекватная концентрация должна находиться в диапазоне от 140 до 180 нанограмм на микролитр при 100 микролитрах чистого запаса в каждую лунку 96-луночной пластины с плоским дном, и инкубировать пластину в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия в темноте, чтобы покрыть лунки через 12-20 часов, использовать микроскоп для проверки образования равномерного монослоя бесклеточных сеток на дне лунок. После того, как монослой будет проверен, аккуратно отсасывайте весь неадгезивный материал из лунок.

Следя за тем, чтобы не нарушить монослой внизу. Это самый сложный аспект этой процедуры. Для того, чтобы поддерживать достаточный сетчатый монослой, вы должны обращаться с плитой очень осторожно.

Медленно добавляйте все реагенты и ячейки на боковой стороне лунок, очень осторожно аспирируйте и избегайте касания дна лунки всасывающим наконечником. Удалив неадгезивный материал, аккуратно добавьте в каждую лунку 100 микролитров 1%-ного раствора для блокирования бычьего альбумина и оставьте на один час при комнатной температуре. Не взбалтывайте и не трясите пластину, так как это может нарушить монослой сетки.

Затем подготовьте 5 49 раковых клеток, собрав их, когда они слиты на 70-80%. Используя стандартные методики, повторно суспендируют клетки в среде в концентрации от двух до 10 до четвертой клетки на 100 мкл. Окрашивайте клетки, добавляя один микролитр CFS e на миллилитр среды, и оставьте их при комнатной температуре на 10 минут.

Затем центрифугируйте клетки при 450-кратной G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Отбрасывают надосадочную жидкость и ресуспендируют клетки в исходном объеме среды для поддержания концентрации в два раза по 10 до четвертой раковых клеток на 100 микролитров среды. Возьмите пластину с сетчатым покрытием и осторожно аспирируйте блокирующий раствор.

Затем добавьте по 100 микролитров суспензии раковых клеток в каждую лунку и дайте клеткам прилипнуть к пластине в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, полностью отсадите жидкость и добавьте 1000 единиц ДНК, по одной в некоторые лунки на 10 минут, чтобы разрушить сетки в других лунках. Добавьте 100 микролитров стерильной воды на лунку в течение 10 минут в качестве транспортного средства. Далее аккуратно отсасывайте жидкость из каждой лунки и промойте 100 микролитрами PBS, чтобы удалить любую неприлипающую жидкость.

А 5 49 клеток отсасывают и отбрасывают весь раствор в лунки, оставляя на дне только сетки и прилипшие раковые клетки. Затем добавьте 100 микролитров 4%-ного раствора формальдегида в лунку для фиксации клеток, немедленно перенесите планшет в флуоресцентный микроскоп для считывания анализа, а затем нанесите график и проанализируйте результаты. Использование программного обеспечения для анализа данных.

Бесклеточные сетки были использованы в анализах статической адгезии с 5 49 раковыми клетками. Световая микроскопия показала, что раковые клетки прочно прилипают к сетчатому монослою. В пробирке.

Эта адгезия уменьшилась после того, как чистый монослой был разрушен с помощью ДНК; одна флуоресцентная микроскопия меченых 5 49 раковых клеток подтвердила эти результаты. Связывание 549 элементов с чистым монослоем количественно определялось путем подсчета количества ячеек в поле высокой мощности. Как показано на рисунке, не было никаких изменений в адгезии раковых клеток к сеткам в системе управления транспортным средством.

Тем не менее, наблюдалось значительное снижение адгезии раковых клеток к НЭТ в присутствии ДНК-одной. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как изолировать и обрабатывать сетки из цельной человеческой крови. Эти бесклеточные сетевые изоляты затем могут быть использованы в различных методах, включая иммунофлуоресценцию, конфокальную микроскопию, электронную микроскопию и вестерн-блоттинг.