Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели

Общая цель этой процедуры заключается в создании 3D-тканевой инженерной модели эпителия пищевода человека для использования в качестве экспериментальной платформы. Это достигается путем выделения нормальных фибробластов пищевода и эпителиальных клеток человека из образцов ткани пищевода человека. На втором этапе фибробласты засеиваются на эпителиальный ацеллюлярный, поровый знак, пищеводный каркас и культивируются в течение семи дней.

Затем каркас переворачивают и в культуру добавляют выделенные эпителиальные клетки пищевода человека в течение четырех дней. На последнем этапе модель перемещается на границу раздела воздушной жидкости на следующий пятидневный период культивирования, что позволяет развиться зрелому стратифицированному эпителию. В конечном счете, иммуногистохимия используется для характеристики ключевых маркеров пролиферации и дифференцировки, экспрессируемых модельными эпителиальными клетками.

Основные преимущества этого метода по сравнению с обычной 2D-культурой клеток заключаются в том, что он позволяет клеткам взаимодействовать между клетками, клетками и клеточным матриксом, которые они имели бы in vivo. И с помощью этой техники мы можем получить зрелый многослойный плоский эпителий, похожий на нормальный пищевод. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности по трем причинам.

Во-первых, может быть сложно гарантировать, что большинство эпителиальных клеток не дифференцируются перед включением в каркас. Во-вторых, необходимо позаботиться о том, чтобы обеспечить правильную воздушно-жидкую границу раздела в период созревания эпителия. И в-третьих, может быть непросто поддерживать ее на протяжении всего периода культуры.

Чтобы изолировать эпителиальные клетки пищевода человека, поместите собранную ткань плоской слизистой оболочки пищевода в стерильную чашку Петри и с помощью стерилизованного этанолом скальпеля разрежьте ткань на полоски по 0,5 сантиметра. Затем инкубируйте ткань в 0,1%-ном триине, покрытом 37 градусами Цельсия, остановив пищеварение через час с пятью миллилитрами FCS. Затем, удерживая полоски щипцами, аккуратно соскребите эпителиальную поверхность лезвием скальпеля в течение одной-двух минут на полоску, чтобы удалить эпителиальные клетки в окружающую среду, когда все полоски будут соскоблены, перенесите среду, содержащую отделенные эпителиальные клетки, в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

После раскручивания клеток выбросьте сенну и повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах эпителиальной среды. Затем отбросьте среду из культуры клеток и используйте стерильную пипетку, чтобы наложить эпителиальные клетки на питающие клетки, чтобы изолировать фибробласты пищевода человека. Переложите соскобленные полоски ткани в стерильную чашку Петри и, наконец, измельчите ткань скальпелем.

Переварите кусочки в 10 миллилитрах 0,5%-ной коллагеназы, растворе, накрытом температурой 37 градусов Цельсия и 5%-ным углекислым газом, с увлажненной атмосферой на ночь. На следующий день переложите диджест в 50-миллилитровую центрифужную пробирку и раскрутите ячейки. Резус суспендирование неба в 10 миллилитрах культуры фибробластов Medium.

Культура в колбе Т 75 в инкубаторе для клеточных культур. Для приготовления децеллюляризованного пищевода свиньи начинают с того, что с помощью ножниц и пинцета разрезают пищевод свиньи в продольном направлении. Затем промойте пищевод в 180-миллилитровой стерильной кастрюле, содержащей 100 миллилитров стерильного PBS, в течение 10 минут с легким встряхиванием, чтобы удалить любые дневные загрязнения во время полоскания ткани.

Распылите на доску для вскрытия пробки 70% этанола, когда пробка высохнет в пищеводе, на доску слизистой стороной вверх. Теперь используйте стерильный пинцет, чтобы захватить поверхность слизистой оболочки на одном конце пищевода и оттянуть ткань от доски, чтобы отделить слизистую оболочку от нижележащей подслизистой оболочки. Затем с помощью стерильного лезвия скальпеля рассеките пищевод в продольном направлении вдоль собственной полосы, удаляя штифты по мере рассечения, чтобы позволить отвести слизистую оболочку.

Отбросьте нижележащую подслизистую оболочку и с помощью скальпеля разрежьте оставшуюся слизистую на квадратные кусочки по пять сантиметров. Промойте кусочки в 150 миллилитрах стерильного PBS с легким помешиванием, как только что продемонстрировано. Через пять минут переложите ткань в кастрюлю объемом 180 миллилитров, содержащую 150 миллилитров одного молярного раствора хлорида натрия.

Дополняется антибиотиками при 37 градусах. Через 72 часа переведите ткань в 150 миллилитров стерильного PBS, после чего эпителий начнет заметно отделяться от подлежащей ткани. Используйте стерильные щипцы и лезвие скальпеля для удаления отслоившегося эпителия и поместите оставшуюся ткань в свежую кастрюлю со 150 миллилитрами стерильного PBS с тремя пятиминутными полосканиями с легким перемешиванием, теперь ткань должна храниться в глицерине не менее четырех месяцев.

Чтобы полностью стерилизовать каркас, начните подготовку модели слизистой оболочки пищевода с регидратации частей свиного каркаса, которые были стерилизованы в глицерине в течение не менее четырех месяцев. В 100 миллилитрах стерильного ПБС за пять, 10 минут перемешивания. Замена супината на свежий PBS для каждой стирки.

После пятого перемешивания тест на стерильность скаффолда при ночной инкубации в 100 миллилитрах DMEM при 37 градусах Цельсия. На следующее утро переложите скаффолды в отдельные лунки шестилуночной пластины подслизистой стороной вверх. Затем поместите стерильное кольцо из медицинской нержавеющей стали в центр каждого каркаса и с помощью стерильных щипцов аккуратно надавите на кольца, чтобы обеспечить достаточное прилегание ткани пять раз.

Центрируйте пять фибробластов пищевода человека в 0,2 миллилитрах фибробластной среды в центре каждого кольца. Затем затопите область вокруг внешней стороны кольца еще не менее чем двумя миллилитрами среды фибробластов и инкубируйте скаффолды в инкубаторе для клеточных культур. Через 24 часа снимите кольца и замените среду в каждой лунке не менее чем пятью миллилитрами свежих фибробластов.

Средний, следящий за тем, чтобы леса были полностью погружены. Через неделю откажитесь от среды и с помощью щипцов переверните поверхность слизистой оболочки скаффолда лицевой стороной вверх. Поместите кольца обратно на каркасы, а затем добавьте по одному временному центру из шести эпителиальных клеток в 0,2 миллилитрах составной среды, по одному в центр каждого кольца.

Закупорьте участок за пределами кольца примерно двумя миллилитрами композитного среднего и верните конструкции в инкубатор. Через 24 часа снимите кольца и замените среду в каждой лунке не менее чем пятью миллилитрами свежей композитной среды, одним, убедившись, что скаффолды полностью погружены в воду. Еще через 24 часа замените среду не менее чем пятью миллилитрами композитной среды. Два.

На четвертый день поместите стерильные сетки из медицинской нержавеющей стали в лунки новой шестилуночной пластины и перенесите конструкции на слизистую оболочку сетки вверх. Наконец, добавьте достаточное количество композитной среды три, чтобы достичь нижней стороны композита, оставляя поверхность открытой для воздуха, гарантируя, что образец сохраняется на границе раздела воздушно-жидкостных компонентов. Самая сложная часть процедуры — это настройка интерфейса воздушно-жидкостного воздуха.

Если неясно, находится ли решетка в жидком контакте со стерильным наконечником трубы, так как легче увидеть, погружена ли трубка в воду. В качестве альтернативы вы можете попробовать осторожно покачивать пластину, так как так легче увидеть жидкость при ее движении, и убедиться, что жидкость есть на решетке и не покрывает ваш образец. Таким образом, логическая оценка эпителия представляет собой зрелый многослойный многослойный плоский эпителий, похожий, но более тонкий, чем тот, который наблюдается в нормальном пищеводе человека, при этом клетки становятся все более плоскими и, в конечном счете, ядерными по мере их миграции к поверхности.

Иммуногистохимическая характеристика ключевых маркеров пролиферации и дифференцировки показывает, что микроанатомия модельного эпителия сходна с микроанатомией нормального пищеводного эпителия человека. Например, сопоставимая экспрессия цитокератина 14 наблюдается как в нативном пищеводе, так и в модельном эпителии, при этом окрашивание ограничено клетками базального слоя. Эта модель была успешно модифицирована для включения опухолевых клеток путем замены первичных эпителиальных клеток клетками карциномы, что свидетельствует о гибкости модели.

Например, клетки плоскоклеточной карциномы производят эпителий, видимый на конструкции в виде определенной желтой области с большими расщелинами внутри эпителия, что, вероятно, отражает присутствие дисфункциональных молекул целлии, включая клетки аденокарциномы пищевода в модели, что приводит к большому количеству деградации каркаса, видимой глазу в виде истончения каркаса. После этой процедуры к той же ткани могут быть применены другие методы экспрессии генов, такие как северный или западный блоттинг, чтобы ответить на такие вопросы, как: Как эпителий реагирует на стрессы окружающей среды? Таким образом, это действительно ценный ресурс для более глубокого изучения большего количества вопросов после его разработки.

Этот метод проложил путь для исследователей, заинтересованных в метаплазии Барретта, для изучения влияния воздействия конкретных компонентов рефлюкса на экспрессию генов в нормальном пищеводе человека.