Выделение мононуклеарных клеток из центральной нервной системы крыс с EAE

Здравствуйте. Меня зовут Кристин Битон. Я ассистент-исследователь в лаборатории Джорджа Чена на кафедре физиологии и биофизики Калифорнийского университета в Ирвайне. Сегодня я покажу вам, как выделить мононуклеарные клетки из центральной нервной системы крыс.

Данная процедура предполагает глубокую анестезию крысы для проведения сердечной перфузии, чтобы исключить наличие остаточной крови в центральной нервной системе. После этого мы извлечем головной и спинной мозг, подготовим суспензию единичных клеток с помощью клеточного сита, а затем изолируем мононуклеарные клетки, используя двухслойный градиент Percoll. Итак, приступим.

Теперь я готов приступить к перфузии сердца, поэтому я покажу все необходимые для этого материалы. Первое, что нам понадобится, — это колокол Белла, на дно которого мы положили бумажные полотенца, пропитанные летучим анестетиком. Можно использовать галотан или изофлуран.

Далее нам понадобится устройство для фиксации крысы и емкость для сбора крови. Для этого мы используем данную импровизированную установку для перфузии крыс. Вам потребуется игла калибра 21G; перфузия будет проводиться физиологическим раствором, подаваемым самотеком через систему для внутривенного введения.

Если у вас нет доступа к одной из этих систем, вы также можете наполнить несколько шприцев физиологическим раствором и проводить перфузию вручную. Однако данный способ гораздо проще. Кроме того, нам понадобится корпус шприца объемом 10 мл, в который помещены салфетки Kim wipes.

Я добавлю в него немного анестетика, чтобы нанести его на нос крысы и обеспечить глубокую анестезию на протяжении всей процедуры. И, конечно же, понадобятся инструменты. Сегодня я не буду проводить процедуру в стерильных условиях, так как не планирую помещать клетки в культуру.

Все инструменты, которые я использую, не стерильны. Разумеется, если вы планируете поместить клетки в культуру, следует использовать стерильные инструменты. Для целей данного видео я буду использовать погибшую крысу.

Таким образом, я могу выполнять процедуру медленно, чтобы продемонстрировать ее вам шаг за шагом. Разумеется, при проведении реальной процедуры крыса должна находиться под глубоким наркозом, но оставаться живой. Важно, чтобы сердце продолжало биться.

Приступим к работе с крысой. Я поместил крысу на спину мордой от себя и наложил пропитанные салфетки с тиопенталом на нос. Первым делом я проверю, находится ли крыса в состоянии глубокого наркоза.

Поэтому это необходимо сделать перед каждой из указанных процедур. Я беру пинцет и сжимаю кожу крысы; в данном случае реакция полностью отсутствует. Если наблюдается какая-либо реакция, крысу следует вернуть в камеру с газообразным анестетиком, чтобы убедиться, что животное находится в состоянии глубокого наркоза.

Затем я использую 70% ethanol для замачивания верхней половины крысы. После этого я вскрою грудную полость. Сначала я надрежу кожу и раздвину её в стороны.

Затем я открою саму полость. Эта масса здесь — сердце. Здесь вы видите правое предсердие.

Именно здесь я сделаю разрез, чтобы кровь могла вытечь. Затем, для перфузии всего организма, мне необходимо ввести иглу в левый желудочек. Поэтому я введу иглу прямо здесь.

После введения иглы я открою трубку системы внутривенного вливания, чтобы физиологический раствор начал поступать, и оставлю её на 5–10 минут. При хорошей перфузии вы заметите обесцвечивание красной области пульса, носа и, конечно, глаз крысы, что свидетельствует о вымывании крови из организма животного. Это будет означать, что перфузия прошла успешно.

Перед вами крыса после перфузии сердца. Как видите, нос, уши и глаза этой крысы больше не розовые или красные. Они стали полностью белыми, что свидетельствует о том, что перфузия прошла успешно.

Почти вся или вся кровь покинула ткани крысы. Теперь, когда кардиальная перфузия крысы завершена, мне необходимо отсечь ей голову. Мне нужно декапитировать крысу.

Для этого я буду использовать стандартное лабораторное оборудование. Теперь я приступлю к извлечению мозга крысы. Сначала я смочу всю шерсть 70% ethanol, чтобы избежать разлета шерсти вокруг.

Затем я сначала удалю кожу. Поскольку я не планирую использовать мозг для гистологии и собираюсь разрезать его на мелкие части, я не буду проявлять чрезмерную осторожность при его извлечении. Чтобы вынуть мозг целиком, я введу ножницы в основание черепа, там, где мозг соединяется со спинным мозгом, вот здесь.

Затем я сделаю надрезы кости с каждой стороны и удалю верхнюю часть. Я буду повторять эти действия до тех пор, пока мозг не будет полностью обнажен.

Как вы видите, перфузия прошла успешно, так как ткань мозга полностью обесцвечена. У животного, которому не проводили перфузию, верхний слой мозга был бы полностью покрыт красными капиллярами, кровеносными капиллярами; здесь же их совсем не видно, что свидетельствует о качественном проведении перфузии. Теперь я извлеку мозг, стараясь не оставить обонятельную луковицу, и помещу его в пробирку с охлажденным PBS.

Теперь, не стараясь сохранить орган в полной целостности, я помещу мозг в пробирку с PBS, перережу зрительные нервы, после чего с помощью шпателя он довольно легко извлечется. Теперь я извлеку спинной мозг из той же крысы. В данном случае, поскольку мы будем разрезать его на мелкие фрагменты, я не буду стремиться к предельно аккуратному извлечению, главное — извлечь его полностью.

Сначала я делаю разрез кожи вдоль всего позвоночного столба; здесь он виден. Затем я удалю мышечную ткань, чтобы полностью обнажить позвоночный столб. И прямо здесь вы можете видеть спинной мозг.

Таким образом, у мыши можно разрезать оба конца и ввести PBS с помощью шприца, после чего спинной мозг выйдет почти целиком. Однако у крыс это не так просто. Мне приходится вскрыть канал и извлечь спинной мозг ложкой.

Теперь я делаю разрезы с обеих сторон и, как я делал с головным мозгом, разрезаю и удаляю кость, чтобы обнажить спинной мозг. Как и в случае с головным мозгом, спинной мозг полностью белый, что свидетельствует о том, что кардиальная перфузия прошла успешно. Я выполню эту процедуру вдоль всего позвоночного столба.

Затем я опускаюсь примерно до уровня правого бедра, который находится здесь. После этого я с помощью пинцета — это выглядит не очень аккуратно, но я просто извлеку спинной мозг и помещу его в пробирку с мозгом. Таким образом, теперь в моей пробирке находятся и мозг, и спинной мозг крысы, и я готов к приготовлению суспензии единичных клеток.

Теперь я готов подготовить суспензию из отдельных клеток центральной нервной системы. Для этого мне понадобятся чашка Петри диаметром 10 см, в которую я помещу клеточный фильтр с размером пор 70 мкм. Также я буду использовать поршень от шприца объемом 1 мл, а также пинцет и ножницы.

Теперь я помещу образец в клеточный фильтр (cell strainer), убедившись, что в пробирке ничего не осталось. Затем я измельчу ткани, смешав головной и спинной мозг, на мелкие кусочки. Когда всё будет окончательно измельчено, я с помощью поршня шприца Oneill промну образец сквозь фильтр.

Вы заметите, что PBS за пределами тренажера для клеток будет постепенно становиться более мутным по мере прохождения отдельных клеток. Разумеется, если бы мне потребовалось перемешать суспензию клеток, я бы сделал это в ламинарном шкафу для культур тканей и не опускал бы в нее пальцы. Теперь, когда PBS стал мутным, я соберу его впервые и помещу в пробирку объемом 50 мл.

Но я также буду внимательно следить за процессом; я добавлю еще немного PBS в клеточный фильтр и протру содержимое через него. Поскольку ЦНС содержит очень много жира, этот орган является одним из самых сложных для подготовки клеточной суспензии с помощью данного метода. Я несколько раз прогнал всю ткань ЦНС через клеточный фильтр и собрал всю полученную суспензию одиночных клеток.

А здесь пробирка, которую я дополнена до 50 мл PBS, содержащим мою суспензию единичных клеток, приготовленную из ЦНС справа. Теперь я центрифугирую эту пробирку, чтобы подготовить её к градиенту; центрифугирование завершено. Теперь у нас есть осадок, поэтому я удалю супернатант и повторно суспендирую клетки в 20 мл 30% раствора Percoll в PBS.

Затем я перенесу это в 10 мл 70% перкола в PBS для проведения градиентного центрифугирования. После этого я удалю супернатант. Я раздроблю осадок, чтобы убедиться, что клетки находятся в виде однородной суспензии, а не в виде комка в осадке.

Теперь у меня есть суспензия клеток ЦНС в виде одноклеточной суспензии. Я перевзвешу эти клетки в 20 мл 30% раствора Percoll в PBS, а затем наслою эти 20 мл поверх 10 мл 70% раствора Percoll в PBS. После этого я центрифугирую пробу.

Теперь я возьму 20 мл суспензии ЦНС и медленно наслою ее на слой Percoll 70% для облегчения процесса. В один из слоев также можно добавить краситель, например феноловый красный, но я не совсем уверен, оказывает ли он какое-либо влияние на клетки. Поэтому я стараюсь этого избегать.

Необходимо двигаться достаточно медленно, чтобы два слоя не смешались, поэтому следует избегать сильной турбулентности в нижнем слое. По мере увеличения толщины верхнего слоя скорость можно повышать. Теперь я добавил клетки в градиент.

Таким образом, прозрачный нижний слой представляет собой слой Percoll 70%, а мутный верхний слой — слой Percoll 30%, содержащий мою суспензию единичных клеток. Теперь я помещу эту пробирку в центрифугу на 20 минут; если все сделано правильно, я смогу визуализировать слой мононуклеарных клеток. Итак, центрифугирование градиента завершено.

Таким образом, как обычно, центрифугируйте образец для создания градиента, при этом будьте очень осторожны и отключите тормоз, чтобы он не нарушил градиент из-за слишком резкого замедления. Теперь у нас сформировались слои. Сверху над градиентом находится слой жира, который я удалю, чтобы избежать загрязнения суспензии клеток.

На границе раздела между двумя слоями Pergel 30% и 70% видно, что эта граница не четкая, а размытая, и именно там находятся клетки. После того как я удалю клетки, вы увидите, что граница станет гораздо более четкой. Поэтому я просто удалю основную часть жира из верхнего слоя и помещу его в отходы.

Мне не нужно удалять все содержимое, но я хочу убрать достаточное количество, чтобы раствор не полностью покрывал пипетку, когда я опущу ее за клетками мононуклеаров. Теперь, используя другую переносную пипетку, я опущусь до уровня интерфейса и соберу клетки. Таким образом, я собрал несколько миллилитров содержимого из интерфейса.

Таким образом, я, вероятно, собрал все доступные клетки. Количество мононуклеарных клеток в этой ЦНС было очень малым. Теперь мои мононуклеарные клетки находятся в пробирке.

Я наполню эту пробирку фосфатно-солевым буфером (PBS) до 50 мл и центрифугирую клетки для получения осадка, чтобы вымыть Perle. Я рекомендую промыть их как минимум дважды, используя полный объем PBS в пробирке, чтобы убедиться, что весь Perle удален. После этого клетки готовы к любой процедуре, которую вы планируете с ними провести.

Сегодня я продемонстрировал вам способ выделения мононуклеарных клеток из центральной нервной системы крыс. Разумеется, после получения этих мононуклеарных клеток их можно дополнительно очистить, чтобы выделить из популяции, например, T-лимфоциты. С полученными клетками я проведу анализ методом проточной цитометрии для определения клеточных популяций, присутствовавших в мозге.

И удачи в изоляции клеток.