Поверхность Enhanced спектроскопии комбинационного рассеяния света обнаружения биомолекул Использование EBL, изготовленных наноструктурированных Субстраты

Общая цель данного эксперимента заключается в изготовлении и определении характеристик сопряженных нанобиологических систем, взаимодействующих с твердыми наноструктурированными субстратами с иммобилизованными биомолекулами. Это достигается за счет использования электронно-лучевой литографии со сверхвысоким разрешением или EBL для получения массивов крошечных металлических наноструктур на носителях из плавленого кремнезема. На втором этапе субстраты помещаются в раствор, и биомолекулы иммобилизуются на их поверхности, создавая нанобиологические интерфейсы.

Затем используется спектроскопия рамена с улучшенной поверхностью или SIRS для зондирования биологических молекул на границах раздела. Полученные спектры sir демонстрируют характерные для конкретных молекул моды рамен с интенсивностью, сильно зависящей от конструкции подложки. Основное преимущество нашего подхода перед существующими методами, такими как инфракрасная спектроскопия, заключается в том, что чувствительность может быть значительно увеличена за счет поверхностной плазмы и резонанса внутри металлических наноструктур.

Наш подход позволяет создавать высокоселективные поверхности, которыми можно легко управлять с помощью комбинации молекулярной функционализации и электронно-лучевой литографии. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в различных областях: от поисковых исследований в структурной биологии или услуг, мобилизуемых полимерами, до разработки различных устройств с использованием нанобиологических интерфейсов. Эти методы могут дать научное представление о структурных свойствах биомолекул с последствиями, распространяющимися на медицинскую диагностику или обнаружение окружающей среды.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности, поскольку он включает в себя аспекты нанопроизводства, функционализации поверхности, биохимии и спектроскопии, которые традиционно не были связаны между собой. Для этого используйте вращатель пластин с вакуумным патроном и поместите образцы по отдельности в центр патрона. Поместите одну каплю резиста ПММА на центр образцов с помощью стеклянной пипетки.

Затем вращайтесь со скоростью 3 500 об/мин в течение 60 секунд с двухсекундным временем ускорения. Затем запекайте подложки при температуре 180 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут после запекания подложек, охлаждайте образцы до комнатной температуры, охлаждая подложки, и верните в спиннер. Нанесите на подложку каплю проводящего полимера.

Вращайте подложку в течение 40 секунд со скоростью 3000 об/мин с двухсекундным нарастанием после отжима. Запекайте образцы при температуре 80 градусов Цельсия в течение одной минуты после выполнения электронно-лучевой литографии или воздействия EBL, как описано в текстовом протоколе, подготовьте стакан с ионизированной водой для удаления проводящего полимера. Затем приготовьте второй стакан с проявителем и помешивайте в течение пяти минут, установив комнатную температуру.

Наконец, приготовьте изопропанол в третьем стакане в качестве ополаскивателя с помощью пинцета. Поместите образцы в воду на три секунды, чтобы удалить проводящую полимерную пленку. Затем поместите образец в проявитель и медленно перемещайте пинцет вверх и вниз в течение 20 секунд, немедленно перенесите субстраты на изопропанол и промойте еще 10 секунд, прежде чем высушить образец азотом, загрузите образцы вверх ногами в систему электронно-лучевого испарителя, чтобы испарившийся металл мог осаждаться на передней поверхности образцов.

Нанесите слой золота толщиной 10 нанометров на образцы для первого и третьего образцов и слой серебра толщиной 10 нанометров для дизайна. Два со скоростью примерно 0,1 нанометра в секунду. Затем заполните водой ультразвуковую систему до рекомендуемой высоты и наполните отдельным стаканом ацетон.

Положите образец лицевой стороной вверх на дно стакана и дайте образцу впитаться в течение 10 минут, держа стакан. Поместите его на водяную баню и позвольте высоте ацетона соответствовать высоте воды. Затем включите систему ультразвука.

Позвольте ультразвуковой обработке происходить в течение 60 секунд. Для подготовки дизайна одного образца сначала приготовьте один миллимолярный раствор MUA и этанола при комнатной температуре и обработайте ультразвуком в течение 10 минут. Погрузите соответствующую наноструктурированную подложку в раствор MUA на 48 часов.

Затем трижды промойте пробу этанолом и просушите в течение пяти минут. Установите комнатную температуру. Далее приготовьте 75 миллимолярный раствор EDC и дистиллированной воды.

Также приготовьте 15 миллимолярный раствор NHS в дистиллированной воде с помощью микропипетки, 100 микролитров NHS на золото на подложке и сразу же добавьте 100 микролитров EDC на ту же область. Инкубируйте в течение одной минуты, чтобы активировать самоорганизующийся монослой MUA. Затем поместите 100 микролитров капли белка, раствор на тот же участок субстрата.

Поместите образец в одну камеру чашки Петри, а в другую — один миллилитр дистиллированной воды. Закройте чашку Петри крышкой и храните образец в течение 24 часов при температуре пять градусов Цельсия. Далее промойте образец в дистиллированной воде три раза непрерывно в отдельных стаканах по 20 секунд в каждом стакане, не давая образцам высохнуть после промывки или во время полоскания для конструкции двух образцов.

Приготовьте 0,9 миллимолярного раствора глюкозосвязывающего белка или ГБП в буфере из фосфата калия. Также приготовьте 100 миллимолярный раствор ДГ глюкозы в буфере. Далее смешайте 30 микролитров раствора глюкозы D и 30 микролитров раствора GBP.

Используя пластиковый контейнер для микропробирок объемом один миллилитр и микропипетку, инкубируйте в течение 30 минут, затем нанесите на подготовленные субстраты 20 микролитров раствора GBP, свободного от лиганда, и 20 микролитров связанного с лигандом раствора GBP. С помощью микропипетки храните образцы при температуре пять градусов Цельсия в течение 24 часов в чашке Петри с герметичной крышкой. Промойте образцы три раза в буферном растворе фосфата калия при комнатной температуре для приготовления.

В трех образцах разбавляют дофаминсвязывающий апре или раствор DBA до концентрации одного микромоляра. Используя буфер tris EDTA с конечным pH 7,4, приготовьте раствор дофамина с концентрацией пять микромоляров, отмерив порошок дофамина на аналитических весах и смешав его с фосфатно-солевым буфером или PBS с помощью шарика для перемешивания в течение пяти минут. Затем нанесите каплю 20 микролитров раствора DBA на поверхность каждой подложки и дайте образцу постоять в течение часа при комнатной температуре, накрыв чашку Петри крышкой.

После трехкратной промывки образцов в буфере с фосфатом калия поместите образцы вертикально на чистую салфетку, чтобы высушить заднюю сторону, сохраняя при этом пленку на лицевой стороне подложки. Отложите образец в сторону в качестве контроля. Далее поместите каплю в пять микролитров раствора дофамина на поверхность имеющегося PBS.

Капните на оставшиеся образцы. Инкубируйте образцы в течение 10 минут, прежде чем промыть образцы в буферном растворе фосфата калия три раза. Для проведения рамен-спектроскопии.

Поместите каждый образец в водонепроницаемую камеру, чтобы избежать испарения при лазерном воздействии. Наполните пластиковый шприц химически инертной высоковакуумной смазкой. Затем поместите образцы на предметные стекла и нанесите несколько миллиметров смазки вокруг образцов, не касаясь образцов.

Поместите крышку микроскопа поверх подложки. Аккуратно надавите, чтобы образовалось уплотнение, создавая тонкую жидкую границу между подложками и защитными стеклами, не допуская контакта буфера с вакуумной смазкой. Используя систему оптического комбинационного микроскопа, получить фокус на поверхности металлической нанографической области, подлежащей исследованию, без включения лазера.

Выполните рамановскую выборку, как описано в показанном текстовом протоколе. Вот массивы наноузоров из золота и серебра, никеля на плавленом кремнеземе. Использование электронно-лучевой литографии или EBL позволяет получить превосходное положение и размеры.

Размер контрольной точки и ширина зазора контролируются экспозицией EBL. Здесь отображены массивы шестиугольников из золота и серебра и никеля. Зародышеобразование таких очень тонких металлических слоев приводит к образованию прерывистых структур.

Вот спектр ряда иммобилизованного белка А в дизайне один: интенсивность сигнала от первого массива намного сильнее, чем от второго массива. Сигнал от третьего массива был очень слабым. Очевидно, что расстояние между зазорами является критическим параметром для развязки плазмы и улучшения поверхности отображаемого рассеивания рамена.

Вот спектры глюкозосвязывающего белка, показывающие эффекты различных конструкций субстратов в свободном лиганде и связанном с лигандом состоянии. Наконец, показаны спектры дофаминсвязывающего аптамера для свободных лигандов и связанных с лигандом молекул. Для справки приведен спектр порошка дофамина.

При выполнении этой процедуры важно избегать загрязнения оснований. Так как метод спектроскопии очень чувствителен и у вас могут быть ложные показания с помощью этой процедуры. Для конкретного аналита могут быть определены оптимальные конструкции исходной подложки.

Затем могут быть выполнены другие методы nphy, такие как non-print phy, для улучшения масштабируемости изготовления подложки после ее разработки. Этот метод помог исследователям в области биохимии и биосенсорики обнаруживать биологические молекулы без определенных поверхностей в очень малых количествах, оставаясь при этом в растворе. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как контролировать размер наноструктуры металла и свойства пленки с помощью производственных технологий и как использовать различные стратегии распознавания биомолекул для нацеливания на различные аналиты.