Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Общая цель данной процедуры заключается в прямом количественном определении агрегатов эритроцитов в микроциркуляции в динамике при контролируемых и постоянных скоростях сдвига. Это достигается путем предварительного заполнения двойного Y-образного микроканала суспензиями эритроцитов и фосфатно-солевым буферным раствором, что создает постоянный сдвиг в слое крови. Вторым этапом является визуализация и запись потока с помощью высокоскоростной камеры.

Далее с помощью методов обработки изображений обработайте запись для получения среднего размера агрегатов и распределения агрегатов по размеру в микроканале. Заключительным этапом является определение скорости кровотока путем отслеживания смещения флуоресцентных частиц, введенных в микроканал, между двумя последовательными кадрами. В итоге, на основе скорости кровотока и толщины слоя крови рассчитывается скорость сдвига в микроканале, чтобы соотнести размеры агрегатов с соответствующей локальной скоростью сдвига.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как метод светопропускания, является то, что агрегаты эритроцитов анализируются динамически в микроскопическом сдвиговом потоке, в отличие от статистического анализа в других методах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гемореологии, такие как понимание условий формирования агрегатов эритроцитов и изучение реологического поведения крови в микроциркуляторном русле. Для начала изготовьте микроканалы шириной 120 microns, высотой 60 microns и длиной семь millimeters с использованием стандартных методов фотолитографии.

Затем соберите клетки крови у здоровых добровольцев и приготовьте суспензии эритроцитов с уровнями гематокрита 5, 10 и 15%, как описано в прилагаемом текстовом протоколе; смешайте один миллилитр каждой суспензии эритроцитов с 60 µL 1% раствора, содержащего флуоресцентные трассерные частицы. Осторожно встряхните пробирку для перемешивания раствора. Также смешайте такой же объем трассерных частиц с одним миллилитром PBS при pH 7.4.

Заполните стеклянный шприц объемом 25 µL раствором трассера, содержащим эритроциты, и подготовьте стеклянный шприц объемом 100 µL. Используя раствор трассера в PBS, убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха в системе. Затем поместите микроканал на предметный столик инвертированного микроскопа, подключенного к высокоскоростной камере, способной записывать 18 кадров в секунду или более, и к системе микрочастичной имидж-велоциметрии.

Подсоедините каждый шприц с помощью трубок к одному из входных портов микрофлюидного канала, затем установите их в держатель одного и того же шприцевого насоса. Запрограммируйте шприцевой насос так, чтобы подача из шприца объемом 25 µL осуществлялась со скоростью 2 µL/h. Из-за разницы в объеме это приведет к тому, что подача из шприца объемом 100 µL будет происходить со скоростью в четыре раза выше.

Изменяйте скорость потока между экспериментами для тестирования различных скоростей сдвига. Используйте калибровочную линейку с установленным объективом 20х для калибровки высокоскоростной камеры. Затем запустите насос, чтобы начать подачу двух растворов в микроканал.

Определите оптимальную выдержку камеры для получения четких изображений агрегатов. Важно дождаться установления стационарного режима потока перед началом проведения измерений.

Установив стационарный режим в течение трех-пяти минут, снова наполните шприц, чтобы перемешать смесь и поддерживать эритроциты во взвешенном состоянии. После достижения стационарного потока начните запись перемещения эритроцитов.

Записывайте поток в течение семи секунд. С помощью программы для обработки изображений повысьте контрастность каждого полученного изображения в градациях серого, используя метод выравнивания гистограммы. Затем преобразуйте изображения в градациях серого в бинарные изображения.

Тщательно установите пороговое значение, протестировав несколько вариантов и выбрав то, при котором все агрегаты определяются корректно. При необходимости заполните пустоты, соответствующие разрывам внутри одного агрегата. Затем определите клетки, выявляя соседние белые пиксели на бинарном изображении, чтобы смежные клетки учитывались как агрегаты.

Промаркируйте обнаруженные различные агрегаты эритроцитов, а затем преобразуйте бинарное изображение в RGB-изображение для более качественной визуализации. Наконец, наложите RGB-изображение на исходное изображение. Чтобы проверить эффективность обработки изображений, рассчитайте площадь каждого агрегата, обнаруженного в кадре, на основе количества выявленных пикселей.

Обработайте все кадры аналогичным образом. Затем вычислите среднее значение размеров агрегатов, обнаруженных в каждом кадре, а затем — среднее значение по всем кадрам. Чтобы получить средний размер агрегатов для каждой записи суспензий эритроцитов, переведите результаты в квадратные микрометры, используя калибровочное изображение.

Затем вычислите площадь одного эритроцита, чтобы определить репрезентативное значение. После получения данных оцените количество эритроцитов в каждом обнаруженном агрегате. Переключитесь с высокоскоростной камеры на камеру с двойным импульсом, используемую в системе микрочастичной скоростной визуализации (microparticle image velocimetry).

Для получения изображений потока и последующей обработки данных с целью определения поля скоростей используйте программное обеспечение для визуализации, подобное представленному здесь. Обязательно наденьте защитные очки, после чего включите лазерную систему и камеру. Поместите под микроскоп микрометр и используйте полученное изображение для калибровки системы.

Затем запустите поток жидкости и визуализируйте частицы в обеих жидкостях. Найдите срединную плоскость микроканала, сфокусировавшись на самых быстрых и ярких частицах в потоке. Далее установите временной интервал между кадрами примерно в две миллисекунды, чтобы самые быстрые частицы смещались на 5–10 пикселей между двумя изображениями, и начните запись потока O. Настройте программное обеспечение для получения 100 пар изображений для всех различных суспензий эритроцитов и для разных скоростей сдвига.

После предварительной обработки изображений выберите размер и форму окна корреляции, а также процент перекрытия изображений. Представьте результаты в виде среднего поля скоростей, рассчитанного по 100 парам изображений, и среднеквадратичной ошибки скорости.

Выключите лазер, камеру и компьютер. После завершения всех измерений и обработки изображений рассчитайте скорость сдвига, предварительно определив и оценив толщину слоя крови в микроканале на основе записи высокоскоростной камеры. Для этого усредните все кадры конкретной записи, чтобы получить фоновое изображение видео.

Наконец, определите слой крови путем визуального анализа усредненного изображения всех кадров и вручную обнаружьте границу слоя крови. Затем вручную получите значение скорости для соответствующей толщины слоя крови из извлеченного профиля скорости и рассчитайте скорость сдвига, разделив значение скорости на толщину слоя крови. Представленная здесь толщина соответствует чистому перемещению четырех агрегатов эритроцитов, которые были обнаружены в трех последовательных кадрах.

Крупные агрегаты, состоящие более чем из 30 клеток, показаны красным цветом. Агрегаты среднего размера от девяти до 30 клеток показаны зеленым цветом, а малые агрегаты, состоящие менее чем из девяти клеток, — синим цветом. Скорость агрегата варьируется в зависимости от его положения в показанном микроканале.

Ниже представлены профили скорости эритроцитов при гематокрите 5%, 10% и 15% и скорости потока 10 µL в час. Как и ожидалось, видно, что скорость стремится к нулю у обоих краев, а точка перегиба между двумя потоками немного меняется в зависимости от уровня гематокрита, поскольку с увеличением общей скорости сдвига размер агрегатов при каждом уровне гематокрита снижается. Это происходит из-за того, что сила сдвига в микроканале превышает силу агрегации, что приводит к дезагрегации эритроцитов.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости обеспечения высокого качества изображения потока в микроканале, а также контрастности между движущимися эритроцитами и фоном изображения. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить качественный и количественный анализ агрегатов эритроцитов в условиях контролируемого потока.