Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Общая цель этой процедуры заключается в прямом количественном определении агрегатов эритроцитов в микроциркуляции, динамически при контролируемой и постоянной скорости сдвига. Это достигается за счет первых на тренировках суспензий эритроцитов и двойного y-микроканала с фосфатным буферным солевым раствором, создающих постоянное возбуждение в слое крови. Второй шаг — визуализировать и записать поток с помощью высокоскоростной камеры.

Затем используйте методы обработки изображений для обработки записи и получения среднего совокупного размера и распределения агрегированного размера в микроканале. Заключительным этапом является определение скорости крови путем отслеживания смещения флуоресцентных частиц, введенных в микроканал между двумя последовательными кадрами. В конечном счете, скорость сдвига в микроканале рассчитывается на основе скорости крови и толщины слоя крови, чтобы связать размеры агрегата с соответствующей локальной скоростью сдвига.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как метод светопропускания, заключается в том, что агрегаты эритроцитов анализируются динамически в микроскопическом потоке, в отличие от статистического анализа при использовании других методов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области геморадиологии, такие как понимание условий образования агрегатов эритроцитов и определение радиологического поведения крови в микроциркуляции. Для начала изготовьте микроканалы шириной 120 микрон, высотой 60 микрон и длиной семь миллиметров в соответствии со стандартными методами фотолитографии.

Затем соберите клетки крови у здоровых доноров-добровольцев и приготовьте суспензию эритроцитов с пятью, 10 и 15%-ным уровнем гематокрита, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, смешайте по одному миллилитру каждой суспензии эритроцитов с 60 микролитрами 1%-ного раствора, содержащего флуоресцентные индикаторные частицы. Аккуратно встряхните трубку, чтобы перемешать раствор. Также смешайте одинаковый объем индикаторных частиц с одним миллилитром PBS при pH 7,4.

Загрузите в стеклянный шприц объемом 25 микролитров раствор индикатора, содержащий эритроциты, и стеклянный шприц объемом 100 микролитров. С помощью трассировочного решения в PBS убедитесь, что в системе нет пузырьков. Затем поместите микроканал на инвертированный предметный столик микроскопа, подключенный к высокоскоростной камере, способной записывать 18 кадров в секунду или более, и системе скорости изображения микрочастиц.

Подсоедините каждый шприц через трубку к одному из входных отверстий микрофлюидного канала, а затем загрузите их в держатель того же шприцевого насоса. Запрограммируйте шприцевой насос на подачу шприца объемом 25 микролитров со скоростью два микролитра в час. Это также позволит выдавать шприц объемом 100 микролитров в четыре раза больше из-за разницы в размерах.

Изменяйте скорость потока между экспериментами, чтобы проверить разные скорости сдвига. Используйте калибровочный трюк с 20-кратным объективом для калибровки высокоскоростной камеры. Затем запустите насос, чтобы начать дозирование двух растворов в микроканал.

Определите оптимальную экспозицию камеры. Время для четкой визуализации агрегатов. Важно дождаться, когда поток достигнет устойчивого состояния, прежде чем проводить какие-либо измерения.

Если установившееся состояние теперь достигнуто в течение трех-пяти минут. Наполните шприц до полного наполнения смесью и поддержания эритроцитов во взвешенном состоянии. Как только будет достигнут устойчивый поток, начните записывать движение эритроцитов.

Записывайте поток в течение семи секунд. Используя программу, способную обрабатывать изображения, увеличьте контрастность для каждого изображения в оттенках серого, сделанного с помощью метода эквалайзера гистограммы. Затем преобразуйте изображения в оттенках серого в двоичные изображения.

Тщательно установите пороговое значение, проверив несколько значений и выбрав значение, для которого все агрегаты будут правильно обнаружены. При необходимости заполните отверстия, соответствующие промежуткам внутри одного агрегата. Затем определите ячейки, определив соседние белые пиксели на двоичном изображении, чтобы соседние ячейки учитывались как агрегаты.

Пометьте различные обнаруженные агрегаты эритроцитов, а затем преобразуйте двоичное изображение в красное, зелено-синее изображение для лучшей визуализации. Наконец, наложите красное, зеленое, синее изображение на исходное изображение. Чтобы проверить эффективность обработки изображения, рассчитайте площадь каждого агрегата, обнаруженного в кадре, на основе количества обнаруженных пикселей.

Обработайте все кадры таким же образом. Затем усредните агрегированные размеры, обнаруженные в каждом кадре, а затем результаты всех кадров. Чтобы получить средний совокупный размер для каждой записи двигателей суспензии эритроцитов, преобразуйте результаты в квадратные микрометры с помощью изображения насмешки.

Затем вычислите площадь одного эритроцита, чтобы определить представителя. Предполагаемое количество эритроцитов в каждом обнаруженном агрегате после получения данных. Используя высокоскоростную камеру, переключитесь на двойную импульсную камеру, используемую для системы скоростной обработки изображений микрочастиц.

Используйте программное обеспечение для обработки изображений, подобное показанному здесь, для получения изображений потока и обработки изображений для определения поля скорости. Обязательно наденьте защитные очки, а затем включите лазерную систему и камеру. Поместите микрометр под микроскоп и используйте полученное изображение для калибровки системы.

Затем запустите поток жидкости и визуализируйте частицы в обеих жидкостях. Найдите среднюю плоскость микроканала, сосредоточившись на самых быстрых и ярких частицах в потоке. Затем установите временной интервал между кадрами примерно в две миллисекунды, чтобы самые быстрые частицы перемещались на 5-10 пикселей между обоими изображениями, и начните запись потока O. Настройте программное обеспечение на получение 100 пар изображений для всех различных суспензий эритроцитов и для разных скоростей сдвига.

Последующая предварительная обработка изображения. Выберите размер и форму окна корреляции, а также процент наложения изображений. Выразите результаты в виде среднего поля скорости, вычисленного из 100 пар изображений и среднеквадратичной ошибки скорости.

Выключите лазерную камеру и компьютер. После того, как все измерения и обработка изображений будут выполнены, рассчитайте чистую скорость, сначала обнаружив и оценив толщину крови в микроканале на основе высокоскоростной записи с камеры. Для этого усредните все кадры в конкретной записи, чтобы получить фоновое изображение видео.

Наконец, определите слой крови, визуально изучив среднее изображение всех кадров и вручную определив край слоя крови. Затем получите значение скорости для соответствующей толщины слоя крови вручную из извлеченного профиля скорости и рассчитайте скорость сдвига, разделив значение скорости на слой крови. Показанная здесь толщина представляет собой суммарные движения четырех агрегатов эритроцитов, которые были обнаружены в трех последовательных кадрах.

Крупные агрегаты из более чем 30 ячеек показаны красным цветом. Средние агрегаты от девяти до 30 ячеек показаны зеленым цветом, а малые агрегаты менее девяти ячеек — синим. Скорость агрегата изменяется в зависимости от его положения в показанном микроканале.

Вот профили скоростей эритроцитов, взвешенных при 5% гематокрита, 10% гематокрита и 15% гематокрита со скоростью потока 10 микролитров в час. Вы можете видеть, как скорость движется к нулю на обоих краях, как и ожидалось, а точка перегиба между двумя потоками потока немного изменяется между уровнями гематокрита, поскольку общая скорость сдвига увеличивает размер агрегатов при каждом падении уровня гематокрита. Это происходит из-за того, что сила в микроканале превышает агрегирующую силу, вызывающую дезагрегацию эритроцитов.

Во время этой процедуры важно помнить о том, что необходимо обеспечить хорошее качество изображения потока в микроканале и обеспечить контраст между протекающими эритроцитами и фоном изображения. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как качественно и количественно анализировать агрегаты эритроцитов в условиях контролируемого потока.