В Vivo Динамика сетчатки микроглии активации во нейродегенерации: конфокальной офтальмоскопической изображений и клеточной морфометрии в мышь Глаукома

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы охарактеризовать динамику микроглии на мышиной модели хронической глаукомы с помощью конфокальной визуализации сетчатки in vivo. Это достигается с помощью неинвазивной ежемесячной конфокальной офтальмоскопии или CSLO для просмотра флуоресцентной микроглии на сетчатке и диске зрительного нерва. Анализ изображений в реальном времени с использованием сегментации и морфографии клеток на основе пороговых значений позволяет количественно измерить количество микроглиальных клеток и их активацию.

Результаты показывают, что ежемесячная визуализация CSLO у живых мышей может быть использована для мониторинга кинетики распределения плотности клеток микроглии и морфологической активации во время раннего прогрессирования хронической нейродегенерации. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как двухфотонная конфокальная визуализация мозга мышей с GFP-положительной микроглией, заключается в том, что визуализация сетчатки CSLO позволяет напрямую наблюдать и контролировать клетки микроглии на протяжении всего прогрессирования нейродегенеративных расстройств старения в интактном организме. Впервые идея этого метода пришла мне в голову после того, как мы продемонстрировали exvivo, что микроглия демонстрирует интенсивную активацию и кластеризацию в центральной готовности молодых мышей DBA через J в возрасте, предшествующем обнаруживаемой нейродегенерации.

Чтобы выяснить, повлияли ли эти ранние врожденные иммунные изменения, которые предшествовали обнаруживаемой глаукоме, на ее нейродегенерацию, нам нужно было разработать подход in vivo для отслеживания изменений микроглии. Демонстрировать процедуру получения изображения в реальном времени будет Цезарь Ромеро, техник моей лаборатории Чтобы начать работу, запустите систему CSLO и введите информацию о сеансе. Затем надежно подготовьтесь к визуализации.

Установите чистую линзу с широким углом обзора 55 градусов. Поместите мышь над платформой визуализации через две минуты после введения анестетика и расширьте оба зрачка с помощью моих татических капель. Через пять минут подтвердите, что мышь находится под наркозом.

Далее, используя минимальное давление, накройте каждый глаз контактными линзами. Ориентируйте мышь так, чтобы правый глаз встречался с линзой объектива, а орбита была параллельна линзе. Животное не нужно удерживать, а поддерживать на постоянном расстоянии от линзы объектива.

Если глаз будет находиться на одной линии в течение следующих 10–15 минут, мышь не будет двигаться или моргать, пока ее движения глаз отслеживаются системой визуализации CSLO в реальном времени. Начните сеанс визуализации со сбора глазного дна внутренней части сетчатки. Для этого.

Выберите инфракрасный режим, который соответствует длине волны возбуждения 820 нанометров. Затем отрегулируйте мощность лазера до 100% и чувствительность от 40 до 60%. Далее, работая на высокой скорости, определите местоположение глаза с помощью джойстика для ориентации офтальмоскопа и приготовьтесь к сбору изображения глазного дна диска зрительного нерва и сосудистой сети сетчатки. Осмотрите роговицу и хрусталик на предмет травм или помутнения.

Исключите из исследования глаза с дефектами или травмами, которые могут повлиять на получение изображения. Теперь, поднеся объектив ближе к глазу, найдите область диска зрительного нерва, которая является поверхностью диска зрительного нерва или ONH. Затем центрируйте изображение на ONH.

Правильное расположение ONH является ключом к получению равномерного фокуса и направления по всему изображению. Следующим шагом является визуализация внутренних плоскостей сетчатки, а также ОГН. Для референсной фокальной плоскости используйте крупные кровеносные сосуды, расположенные на поверхности стекловидного тела сетчатки, что соответствует 59 и 60 диоптриям, или даже глубже на 55 диоптриях в вынутых областях диска зрительного нерва.

Затем отрегулируйте насыщенность изображения с помощью ручки на сенсорной панели, пока белый ореол освещения не покроет большую часть глазного дна вокруг диска зрительного нерва. Затем выберите более низкую насыщенность, которая создает равномерный ореол, указывающий на оптимальный контраст для этого глаза. Если темные участки сохраняются, может потребоваться повторная юстировка камеры.

Теперь соберите изображение глазного дна с высоким разрешением центральной сетчатки, усреднив 30 кадров, сделанных в режиме реального времени, чтобы улучшить соотношение сигнал/шум. Это соответствует 4,7 кадрам в секунду, нормализуемым немедленно и в том же положении, подготовленном для сбора флуоресцентного изображения GFP-положительных клеток. Переключитесь в режим флуоресцентной визуализации на сенсорной панели, которая выбирает синий лазер с лазерным возбуждением 488 нм и набором барьерных фильтров от 460 до 490 нм и устанавливает сбор данных на 100% мощности лазера и чувствительность от 100 до 125%.

Теперь соберите двумерное флуоресцентное изображение с одной точки XY ONH, усреднение 100 сканирований. Затем сделайте многоточечное изображение сетчатки вокруг ONH выберите композит на панели управления, а затем проведите с помощью офтальмоскопа по носовой височной оси. Программное обеспечение автоматически усредняет только что отсканированные области и сшивает их в режиме реального времени.

Если качество изображения участков сетчатки недостаточно для усреднения, зеленый круг, обозначающий сканируемую область, станет красным. Полученное составное изображение покрывает площадь до 1,7 на четыре миллиметра. Следует соблюдать осторожность при получении составного изображения.

Изображения с высоким разрешением могут быть потеряны при слишком быстром перемещении объектива до завершения сканирования, усреднения и сшивки изображений. Когда анестезия начинает ослабевать, сеанс визуализации должен быть завершен, потому что мышь начинает тяжело дышать, и визуализация становится невыполнимой. Начните с последовательного выравнивания изображений глазного дна для временного ряда, используя сосудистую сеть и диск зрительного нерва в качестве ориентиров.

Используя обычное программное обеспечение для редактирования изображений, выровняйте все изображения до тех пор, пока они не пересекутся. Верхнее изображение будет полупрозрачным при перетаскивании. Затем поворачивайте каждое изображение в последовательности до тех пор, пока его основные кровеносные сосуды не перекроются с сосудистой сетью на предыдущем изображении, и сохраните расположение для использования в будущем.

Запишите скорректированный угол для каждого изображения и примените его к соответствующему флуоресцентному изображению с одной точкой XY. Теперь можно идентифицировать отдельные GFP-положительные микроглиальные клетки, локализованные в центральной части сетчатки, открыв выровненные файлы TIFF в Fluor render. Чтобы визуализировать все ячейки, заполните экран изображением и определите вид рендера составной ортогональный и интерполированный.

Затем определяем свойства 0.58 гамма 255 точка насыщения 255 яркость 195 альфа при затенении 1.00. Завершите выделение, выбрав оба канала RG как видимые. Скройте канал B, дважды щелкнув по нему в рамке рабочей области, чтобы сегментировать отдельные ячейки.

Выберите и установите порог красного канала, увеличивая нижний порог до тех пор, пока большинство ячеек не будет замаскировано с минимальным перекрытием и исключая клеточные процессы, сохраняя при этом высокий порог постоянным. Наконец, сохраните файл с замаскированными ячейками с помощью команды capture. Там откройте изображение с замаскированными ячейками в растровом графическом редакторе.

Инвертируйте шкалу серого для прямого наблюдения и установите разрешение до 300 DPI или более. Изображение RGB сохраняется в виде файла TIF. Следующим этапом анализа изображений в реальном времени является микроглиальная сегментация, поэтому сегментация и морфография для идентификации SATA для количественной оценки площади.

Используйте программное обеспечение, способное измерять интенсивность и подсчитывать объекты на основе пороговых значений. Откройте файл TIFF с сегментированными ячейками и выберите масштабирование сплайна для максимального разрешения и красный канал как черно-белый для лучшей визуализации. Затем откалибруйте изображение, определив его горизонтальный диаметр от 1,4 до 1,7 миллиметра в зависимости от возраста для сегментации отдельных клеток.

Итак, MA, применяем пороговые значения интенсивности на красном канале. Откройте функцию пороговой интенсивности в разделе Команда подсчета объектов и обновления учетной записи. Используйте эту функцию для отслеживания двумерных параметров для каждого порогового значения области интереса, представляющей индивидуума.

Итак, далее определите порог интенсивности на гистограмме интенсивности. Выберите от 50 до 60 % из 255 уровней и уточните окончательное пороговое значение отдельных ячеек. Визуально оцените перекрытие между цветовой маской порога синего цвета и периметром сомы серого цвета с помощью элементов управления двоичной панели инструментов или каталога объектов.

Вручную идентифицируйте сомальные области, представляющие интерес, с помощью нескольких клеток. Разделите эти элементы, выделив области интереса. При этом используйте переключатель для прямой визуализации ячеек с помощью ограничения области.

Классифицируйте микроглиальные клетки как активированные. Если площадь их сомат превышает от 50 до 60 квадратных микрон. Классифицируйте микроглии как дезактивированные, если они имеют меньшие размеры соматы.

Наконец, проверьте процесс и проверьте сложность ветвления в каждой активированной микроглиальной клетке путем наложения сомальной маски и одного точечного изображения XY с увеличением контраста на 50%. Описанный протокол был использован для визуализации микроглиальных клеток на большой площади центральной сетчатки. У молодых мышей DBA two J гетерозиготно экспрессирующих CX три C one GFP, высокое разрешение клеток в сочетании с живым изображением, пороговым измерением и морфометрическим анализом позволило автоматически сегментировать отдельные GFP-положительные клетки, и поэтому клетки дискриминируются на основе площади DBA two J мышей моделируют хроническую глаукому и ежемесячно визуализируются для мониторинга развития локального микроглиоза и активации микроглии в возрасте, протекающем обнаруживаемой нейродегенерации, соответствующей вариабельному прогрессирование нейродегенерации в отдельных глазах. Этот анализ выявил изменения активации микроглии сетчатки и микроглиоза с течением времени.

Анализ также обнаружил динамические изменения плотности общей и активированной микроглии в отдельных сетчатках. Плотность популяции микроглии не была связана с изменениями плотности клеток, экспрессирующих GFP, что согласуется с другими результатами. Таким образом, анализ CSLO может быть использован в качестве индикатора раннего прогрессирования заболевания.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить о тщательной оптимизации уровней насыщения флуоресцентного изображения GFP плюс микроглии, локализованной внутренней сетчатки, воспроизводимости изображений центральной сетчатки CSLO, а также постоянной клеточной детализации, обнаруженной в центральной части сетчатки. Этот протокол визуализации в реальном времени применяется в нашей лаборатории, чтобы по-настоящему установить потенциальную связь между ранними изменениями микроглии головы сетчатки и зрительного нерва и более поздним прогрессированием глаукомы при DBA до JM и при других моделях хронической дегенерации сетчатки. Эта стратегия визуализации в реальном времени также может позволить раннее выявление других хронических патологий, которые также нацелены на сетчатку и зрительный нерв для дегенерации, таких как рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и Паркинсона.