В Vivo Динамика сетчатки микроглии активации во нейродегенерации: конфокальной офтальмоскопической изображений и клеточной морфометрии в мышь Глаукома

Общая цель следующего эксперимента заключается в характеристике динамики микроглии в мышиной модели хронической глаукомы с помощью конфокальной визуализации сетчатки in vivo. Это достигается путем неинвазивной ежемесячной конфокальной офтальмоскопии или CSLO для наблюдения за флуоресцентной микроглией на сетчатке и в головке зрительного нерва. Анализ живых изображений с использованием сегментации тел клеток на основе пороговых значений и морфометрического анализа позволяет количественно оценить изменения числа и активации клеток микроглии.

Результаты показывают, что ежемесячная CSLO-визуализация живых мышей может быть использована для мониторинга кинетики распределения плотности микроглиальных клеток и их морфологической активации на ранних стадиях прогрессирования хронической нейродегенерации. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами, такими как двухфотонная конфокальная визуализация GFP-положительной микроглии в головном мозге мыши, является то, что CSLO-визуализация сетчатки позволяет осуществлять прямое наблюдение и мониторинг микроглиальных клеток на протяжении всего процесса развития нейродегенеративных заболеваний, связанных со старением, в неповрежденном организме. Идея этого метода возникла у меня после того, как мы продемонстрировали ex vivo, что микроглия проявляла интенсивную активацию и кластеризацию в центральных областях сетчатки молодых мышей линии DBA/2 в возрасте, предшествующем выявлению признаков нейродегенерации.

Чтобы выяснить, привели ли эти ранние изменения врожденного иммунитета, предшествовавшие выявляемой глаукоме, к нейродегенерации, нам потребовалось разработать подход in vivo для отслеживания изменений микроглии. Демонстрацию процедуры получения изображений в режиме реального времени проведет Цезарь Ромеро, техник моей лаборатории. Для начала работы запустите систему CSLO и введите информацию о сессии. Затем подготовьтесь к безопасному проведению визуализации.

Установите чистый широкопольный объектив с углом обзора 55 градусов. Спустя две минуты после введения анестетика поместите мышь на платформу для визуализации и расширьте оба зрачка с помощью мидриатиков. Через пять минут убедитесь, что мышь находится под воздействием анестезии.

Затем, прилагая минимальное давление, накройте каждый глаз контактной линзой. Расположите мышь так, чтобы правый глаз находился напротив объектива, а орбита была параллельна линзе. Животное не обязательно фиксировать, но необходимо удерживать на постоянном расстоянии от объектива.

В течение следующих 10–15 минут глаз мыши остается выровненным по оси системы; в это время животное не двигается и не моргает, пока система живой визуализации CSLO отслеживает движения его глаз. Начните сеанс визуализации со сбора изображения глазного дна внутренней сетчатки. Для этого.

Выберите инфракрасный режим, который соответствует длине волны возбуждения 820 нанометров. Затем установите мощность лазера на 100%, а чувствительность — в диапазоне от 40 до 60%. Далее, действуя быстро, найдите глаз с помощью джойстика для ориентации офтальмоскопа и подготовьтесь к получению изображения глазного дна с визуализацией диска зрительного нерва и сосудов сетчатки. Осмотрите роговицу и хрусталик на наличие повреждений или помутнений.

Исключите из исследования глаза с дефектами или повреждениями, которые могут повлиять на получение изображений. Теперь, приближая объектив к глазу, найдите область диска зрительного нерва, который представляет собой поверхность головки зрительного нерва (ГЗН). Затем центрируйте изображение на ГЗН.

Правильное позиционирование диска зрительного нерва (ДЗН) является ключом к получению равномерной фокусировки и четкости по всему изображению. Следующим шагом является визуализация внутренних слоев сетчатки, а также ДЗН. В качестве опорной фокальной плоскости используйте крупные кровеносные сосуды, расположенные на витреальной поверхности сетчатки, что соответствует 59 и 60 диоптриям, или даже глубже — 55 диоптриям в областях экскавации диска зрительного нерва.

Затем с помощью ручки на сенсорной панели отрегулируйте насыщенность изображения до тех пор, пока белый ореол освещения не охватит большую часть глазного дна вокруг диска зрительного нерва. После этого выберите более низкий уровень насыщенности, при котором формируется равномерный ореол, свидетельствующий об оптимальном контрасте для данного глаза. Если темные области сохраняются, может потребоваться повторное выравнивание камеры.

Теперь получите изображение глазного дна центральной сетчатки с высоким разрешением, усреднив 30 кадров, полученных в реальном времени, для улучшения соотношения сигнал/шум. Это соответствует скорости 4,7 кадра в секунду; изображение нормализуется немедленно и в той же позиции, где будет проводиться сбор флуоресцентного изображения GFP-положительных клеток. Переключитесь в режим флуоресцентной визуализации на сенсорной панели, выбрав синий лазер с длиной волны возбуждения 488 nanometer и набором барьерных фильтров от 460 to 490 nanometer, и установите параметры сбора данных: мощность лазера 100% и чувствительность от 100 to 125%.

Теперь получите одноплоскостное двухмерное флуоресцентное изображение XY в области диска зрительного нерва (ДЗН), усреднив 100 сканирований по оси X. Затем сделайте многоточечное изображение сетчатки вокруг ДЗН: выберите функцию composite на панели управления, после чего перемещайте офтальмоскоп вдоль назотемпоральной оси. Программное обеспечение автоматически усредняет вновь отсканированные области и объединяет их в режиме реального времени.

Если качество изображения участков сетчатки недостаточно для усреднения, зеленый круг, обозначающий сканируемую область, станет красным. Полученное композитное изображение охватывает область размером до 1,7 на 4 мм. При получении композитного изображения следует соблюдать осторожность.

Изображения с высоким разрешением могут быть потеряны при слишком быстром перемещении объектива до завершения усреднения сканирования и сшивания изображений. Когда действие анестезии начинает проходить, сеанс визуализации необходимо прекратить, так как мышь начинает тяжело дышать и проведение визуализации становится невозможным. Начните с последовательного выравнивания изображений глазного дна для временного ряда, используя сосудистую сеть и диск зрительного нерва в качестве ориентиров.

С помощью стандартного программного обеспечения для редактирования изображений выровняйте все изображения так, чтобы их O hs перекрывались. При перетаскивании верхнее изображение будет полупрозрачным. Затем поворачивайте каждое следующее изображение в последовательности до тех пор, пока его основные кровеносные сосуды не совпадут с сосудистой сетью на предыдущем изображении, и сохраните полученный результат для последующего использования.

Запишите скорректированный угол для каждого изображения и примените его к соответствующему флуоресцентному изображению с одной точкой XY. Теперь можно идентифицировать отдельные GFP-положительные клетки микроглии, локализованные в центральной части сетчатки, открыв выровненные TIFF-файлы в программе Fluor render. Чтобы визуализировать все клетки, разверните изображение на весь экран и установите вид рендеринга «composite orthogonal» и «interpolated».

Затем задайте следующие свойства: 0.58 gamma, 255 saturation point, 255 luminance, 195 alpha при 1.00 shading. Завершите выбор, установив видимость обоих каналов RG. Скройте канал B, дважды щелкнув по нему в окне рабочей области, чтобы сегментировать отдельные клетки.

Выберите красный канал и проведите бинаризацию, увеличивая нижний порог до тех пор, пока большинство клеток не будут выделены маской с минимальным перекрытием и исключением клеточных отростков, при этом оставляя верхний порог неизменным. Наконец, сохраните файл с масками клеток с помощью команды capture. Откройте полученное изображение с масками клеток в растровом графическом редакторе.

Инвертируйте градации серого для прямого наблюдения и установите разрешение 300 DPI или выше. RGB-изображение сохраняется в формате TIF. Следующим этапом анализа прижизненных изображений является анализ микроглии, при котором выполняется сегментация и морфологический анализ для идентификации SATA с целью количественного определения площади.

Используйте программное обеспечение, поддерживающее измерение интенсивности и подсчет объектов на основе порога. Откройте TIFF-файл с сегментированными клетками, выберите сплайн-интерполяцию (spline rescaling) для обеспечения максимального разрешения и установите красный канал в режиме черно-белого изображения для лучшей визуализации. Затем откалибруйте изображение, определив его горизонтальный диаметр в диапазоне от 1.4 до 1.7 мм в зависимости от возраста, чтобы сегментировать отдельные клетки.

Затем примените пороговую фильтрацию интенсивности к красному каналу. Откройте функцию пороговой интенсивности в меню подсчета объектов и обновления данных. Используйте эту функцию для отслеживания двумерных параметров при каждом значении порога для области интереса, представляющей отдельную особь.

Далее определите порог интенсивности на гистограмме интенсивности. Выберите нижние 50–60% из 255 уровней и уточните окончательное значение порога для отдельных клеток. Визуально оцените степень перекрытия синей цветовой маски порога и серого контура сомы клетки, используя элементы управления на панели инструментов бинаризации или каталог объектов.

Вручную определите области интереса в соме, содержащие несколько клеток. Выделите эти элементы, разграничив области интереса. При этом используйте переключатель, чтобы напрямую визуализировать клетки с помощью ограничения области.

Классифицируйте микроглиальные клетки как активированные, если площадь их сом в пределах более 50–60 квадратных микронов. Классифицируйте микроглию как деактивированную, если площадь сом меньше.

Наконец, подтвердите правильность процесса и проверьте сложность ветвления в каждой активированной микроглиальной клетке, наложив маску сомы на одиночное изображение в плоскости XY с увеличением контрастности на 50%. Описанный протокол использовался для визуализации микроглиальных клеток на большой площади центральной сетчатки. У молодых мышей линии DBA 2J, гетерозиготно экспрессирующих CX3CR1-GFP, высокое разрешение клеток в сочетании с живой визуализацией, пороговой обработкой и морфометрическим анализом позволило автоматически сегментировать отдельные GFP-положительные клетки, таким образом, клетки различались по площади. Мыши линии DBA 2J являются моделью хронической глаукомы; их исследовали ежемесячно для мониторинга развития локального микроглиоза и активации микроглии в возрасте, предшествующем detectable neurodegeneration, что соответствует вариабельному прогрессированию нейродегенерации в отдельных глазах. Данный анализ выявил изменения активации микроглии сетчатки и микроглиоза с течением времени.

Анализ также выявил динамические изменения плотности общей популяции и активированной микроглии в отдельных сетчатках. Плотность популяции микроглии не была связана с изменениями плотности GFP-экспрессирующих клеток, что согласуется с другими данными. Таким образом, анализ методом CSLO может быть использован в качестве индикатора раннего прогрессирования заболевания.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости тщательной оптимизации уровней насыщения флуоресцентного изображения GFP-положительной микроглии, локализованной во внутреннем слое сетчатки; воспроизводимость изображений центральной части сетчатки, полученных с помощью CSLO, а также стабильность детализации клеток по всей центральной области сетчатки критически зависят от этого этапа после его разработки. Данный протокол визуализации живых объектов применяется в нашей лаборатории для изучения потенциальной связи между ранними изменениями микроглии сетчатки и головки зрительного нерва и последующим прогрессированием глаукомы у мышей линии DBA/2J и в других моделях хронической дегенерации сетчатки. Эта стратегия визуализации живых систем также может позволить на ранних стадиях выявлять другие хронические патологии, которые приводят к дегенерации сетчатки и зрительного нерва, такие как рассеянный склероз, болезни Альцгеймера и Паркинсона.