Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

Общая цель данной процедуры заключается в выделении нейральных стволовых клеток из паравентрикулярной области спинного мозга взрослой крысы или человека. Сначала спинной мозг извлекают путем ламинэктомии. На втором этапе спинной мозг разрезают поперечно на сегменты длиной один сантиметр и вычленяют паравентрикулярную область из каждого сегмента спинного мозга.

Затем измельченную ткань разрезают на фрагменты размером один миллиметр, после чего проводят ферментативную диссоциацию. Заключительным этапом является отделение целых клеток путем центрифугирования в разрывном градиенте плотности с последующим высевом клеточной суспензии. В итоге возможность формирования нейросфер и рост нейральных стволовых клеток можно оценить с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Сегодня я продемонстрирую, как выделить нейральные стволовые клетки из паравентрикулярной области спинного мозга взрослой крысы. Эти клетки могут быть использованы для поиска ответов на ключевые вопросы в области исследования нейральных стволовых клеток, например, какие экзогенные факторы способствуют ограничению линий дифференцировки или как эти клетки реагируют на различные стимулы или стресс. Для начала подготовьте культуру, среды и буферы для диссекции согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе.

Затем, после введения избыточной дозы анестетика, стерилизуйте кожу крысы и с помощью больших диссекционных ножниц удалите кожу с дорсальной поверхности, обнажая позвоночный столб. Держите диссекционные ножницы перпендикулярно дорсальной поверхности и поперечно. Перережьте позвоночный столб над задними конечностями.

Затем с помощью ножниц меньшего размера сделайте продольный разрез спинной мышцы над позвоночником в ростральном направлении, чтобы обнажить остистые отростки, начиная с открытого каудального конца. Введите небольшой тупой инструмент для сечения кости экстраорально в латеральную часть спинномозгового канала в пространство между спинным мозгом и позвоночником. Расположите лезвие поверхностно и параллельно спинному мозгу.

Затем сделайте небольшие надрезы в дугоотростках и осторожно отслоите их, чтобы обнажить спинной мозг. Такой угол наклона позволяет избежать повреждения подлежащего спинного мозга. Продолжайте удалять дугоотростки в ростральном направлении.

Для обнажения грудного и шейного отделов спинного мозга с помощью тупых анатомических пинцетов аккуратно приподнимите спинной мозг над позвоночником и пересеките корешки микрохирургическими ножницами. Чтобы извлечь спинной мозг, поместите его в чашку Петри с ледяным стерильным буфером для диссекции крыс. Промойте ткань ледяным диссекционным буфером и с помощью ножниц разрежьте спинной мозг поперечно на сегменты длиной один сантиметр. Для каждого сегмента ткани одной рукой удерживайте ткань тонким пинцетом, а другой рукой с помощью микрохирургических ножниц осторожно удалите белое вещество вместе с большей частью серого вещества, оставив только перивентрикулярную область спинного мозга.

Перенесите вырезанную перивентрикулярную ткань в стерильную чашку Петри диаметром 10 сантиметров, содержащую ледяной буфер для диссекции крыс. Чтобы начать изоляцию нейральных стволовых клеток крысы, с помощью микроножниц измельчите вырезанную перивентрикулярную ткань на фрагменты размером один кубический миллиметр. Затем приготовьте буфер для ферментативной диссоциации, добавив сначала пять миллилитров сбалансированного солевого раствора Эрля в флакон с папаином из набора для диссоциации папаином.

Выдержите флакон при температуре 37 °C в течение 10 минут до полного растворения папаина и получения прозрачного раствора. Затем добавьте 500 µL сбалансированного солевого раствора Эрла во флакон с ДНК из набора для диссоциации. Осторожно перемешайте, затем добавьте 250 µL раствора ДНК во флакон с папаином и снова аккуратно перемешайте.

Затем добавьте примерно 0,2 грамма измельченной ткани в пробирку и поместите пробирку на рокер-платформу при 37 °C на 45 минут — один час. После инкубации тритуйте смесь пипеткой на 10 мл, чтобы диссоциировать оставшиеся фрагменты ткани и получить мутную суспензию клеток. Перенесите клеточную суспензию в стерильную коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 G в течение пяти минут.

При комнатной температуре во время центрифугирования приготовьте раствор OVO moid, смешав 2,7 миллилитров сбалансированного солевого раствора Эрла с 300 микролитрами восстановленного раствора ингибитора OVO MOID на основе альбумина. В коническую пробирку объемом 15 миллилитров добавьте 150 микролитров предварительно приготовленного раствора ДНК к раствору oval moid и перемешайте, переворачивая пробирку; удалите супернатант из осадка клеток и немедленно ресуспендируйте клеточный осадок в разбавленной смеси ДНК и ингибитора альбумина. Затем приготовьте разрывной градиент плотности, добавив пять миллилитров раствора ингибитора альбумина в пробирку объемом 15 миллилитров, и с помощью дозатора на 5 миллилитров осторожно и медленно наслоите клеточную суспензию поверх раствора ингибитора альбумина.

Центрифугируйте образец при 70 g в течение шести минут при комнатной температуре. По завершении удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в одном миллилитре предварительно подогретой среды EFH для крыс, приготовленной согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе. Определите плотность живых клеток с помощью гемоцитометра и перенесите клетки в культуральный флакон T 25 с плотностью 10 клеток на микрометр в среде EFH.

Инкубируйте колбы при 37 °C в 5% CO2 и оставьте культуры расти в покое в течение одной недели, чтобы избежать агрегации сфер. Здесь показан поперечный срез спинного мозга крысы, окрашенный luxal fast blue, а также гематином и эозином для визуализации границ белого и серого вещества. Пунктиром обозначена вырезанная оставшаяся перивентрикулярная ткань, которая была изолирована из данной области в соответствии с этим протоколом.

Нейросферы, подобные представленным здесь, будут расти в виде свободно плавающих агрегатов в суспензионной культуре при большом увеличении. Видны микроотростки, выходящие из нейросфер. Нейросферы пролиферируют, что подтверждается положительным окрашиванием на KI 67 в образцах, где нейросферы были диссоциированы и высеяны в лунки, покрытые матригелем. Кроме того, они будут преимущественно экспрессировать nestin, который является маркером нейральных клеток-предшественников.

После выполнения данной процедуры в культуру клеток можно добавить экзогенные факторы для стимуляции дифференцировки. Взрослые нейральные стволовые клетки или их потомки также могут быть трансплантированы в различные модели животных для оценки их способности к регенеративному восстановлению. Надеюсь, это видео окажется полезным, и желаю вам удачи в ваших экспериментах.