Концентрические Гель Система по изучению биофизических роли матриксных микроокружения на 3D миграции клеток

Общая цель этой процедуры заключается в изучении миграционных характеристик клеток в 3D физиологически значимых средах. Это достигается путем предварительного посева клеток во внутренний коллагеновый гель, который затем заключен в бесклеточный внешний коллагеновый гель с желаемыми матричными свойствами. Затем клеткам позволяют вторгнуться и мигрировать во внешнем геле, во время чего их можно контролировать и количественно анализировать.

В конечном счете, этот концентрический анализ геля используется для того, чтобы показать, как биофизические свойства внеклеточного матрикса влияют на миграционное поведение клеток. Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как анализ переноса или анализ царапин, заключается в том, что миграция клетки происходит в физиологически релевантной среде, структурные и биофизические свойства которой очень легко контролировать. Визуальная демонстрация этого метода очень важна, потому что формирование внутренней гелевой системы концентрата является довольно деликатным процессом.

Правильный гелевый интерфейс очень важен для успеха этого эксперимента, которого иногда бывает немного сложно достичь. Начните с культуры MD MBA 2 31 клетки, готовой к забору из колб T 25 при 80% беглости звука. Во-первых, трипсин – это клетки, использующие миллилитр раствора на колбу.

Затем соберите клетки в виде гранул, используя усилие 200 Gs в течение четырех минут, выбросьте нац и повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах культуры. Медиа. Теперь измерьте плотность клеток с помощью гемоцитометра и определите объем, необходимый для 100 миллионов клеток на миллилитр. Затем вращайте ячейки при 200 G в течение четырех минут.

Удалите надосадочную жидкость и тщательно суспендируйте гранулу в необходимый объем бессывороточной питательной среды. Эта подвеска в 10 раз превышает концентрацию окончательных сидений. Для начала соберите необходимые исходные растворы в ведро со льдом, в их состав входят 10 XPBS milq воды и 0,1 моляра гидроксида натрия.

Также охладите несколько микроцентрифужных пробирок под колпаком, поддерживая стерильную технику, выделите желаемое количество коллагена на 50 микролитров 2,4 миллиграмма на миллилитр внутреннего раствора геля. Затем медленно добавьте пять микролитров 10 XPBS к отмеренному коллагену. Поворачивайте пробирку по мере добавления PBS, но избегайте образования пузырьков.

Далее отрегулируйте pH смеси до 7,4 с помощью базового раствора. Обычно достаточно пяти микролитров. Руководство по устранению неполадок приведено в текстовом протоколе.

Наконец, доведите объем до 45 микролитров с помощью бессывороточной питательной среды, оставив место для 10 х клеточной суспензии. Для начала добавьте в раствор коллагена пять микролитров 10 х клеточной суспензии и тщательно суспендируйте клетки в растворе, не образуя пузырьков воздуха. Теперь в предварительно разогретую до стекла нижнюю пластину добавьте 20 микролитров суспензии в центр.

Хорошо образуя куполообразную каплю, если образуется пузырь, быстро разорвите его или всасывайте, не создавая беспорядка. Правильное литье геля может быть очень сложным, особенно при использовании очень вязких растворов, таких как коллаген. Старайтесь как можно больше избегать образования пузырьков и не взбалтывайте раствор, когда он будет готов к полимеризации, потому что набухание может привести к выравниванию искусственных волокон.

Теперь верните чашку в инкубатор на 45 минут, чтобы внутренний слой полимеризовался за 15 минут до окончания инкубации. Приготовьте 200 микролитров раствора наружного коллагенового геля на льду. Во-первых, выделите необходимый объем запасного коллагена.

Во-вторых, медленно добавьте 20 микролитров 10 XPBS с легким взмахом. Затем отрегулируйте pH до 7,4, как и раньше, и доведите раствор до 200 микролитров с Milli Q. Теперь выньте чашку из инкубатора и аккуратно добавьте 180 микролитров раствора внешнего геля поверх внутреннего купола геля.

Для этого следует полностью покрыть внутренний раствор и заполнить лунку. Не перемешивайте раствор и не прикасайтесь к внутреннему раствору геля. Если при выталкивании наружного раствора образуется пузырь, быстро разорвите его или всосайте обратно в пипетку.

Еще один важный шаг — убедиться в том, что получен правильный гелевый интерфейс. Ключевым моментом на этом этапе является добавление наружного раствора геля. Когда внутренний гель еще предстоит сертифицировать.

Кинетика гелинга может варьироваться в зависимости от условий полимеризации, и важно заранее оптимизировать это условие: чтобы дать внешнему гелю полимеризоваться, верните чашку в инкубатор на 45 минут. Через 45 минут гель должен стать достаточно твердым, но его еще можно аккуратно выбить, добавив два миллилитра теплой среды, чтобы гель полностью погрузился. На этом концентрическая гелевая культура подается в свежую среду каждые два-три дня.

В течение нескольких дней клетки начнут мигрировать во внешний матрикс, чтобы наблюдать за их миграцией, окрашивать клетки флуоресцентным трекером. Замените два миллилитра среды свежей средой, содержащей пять микролитров красителя, и инкубируйте в течение 30 минут после инкубационного периода, промывайте культуру с использованием одного миллилитра PB S3 раза в течение двух-трех минут за одну промывку. После мытья снова наполните посуду обычным средством.

Затем установите чашку на микроскоп с контролируемой окружающей средой. Теперь используйте настройку громкости использования, чтобы отсканировать внешние области геля рядом с интерфейсом геля. Обычно сканирование выполняется в квадратных изображениях размером 647 микрон толщиной 100 микрон с использованием интервалов в пять микрон в стеке ZS.

Затем просканируйте промежуточные области и, наконец, просканируйте края геля. Исключите области в пределах 50 микрон от нижней, верхней или боковых поверхностей, чтобы избежать влияния краев на клетки. Чтобы проанализировать движение ячеек на основе собранных данных, сначала откройте файлы изображений в программном обеспечении для анализа данных, таком как imas.

Начните с выбора команды превзойти, а затем области команд. Это приведет к появлению опции отслеживания поверхностей. Со временем выберите интересующую область в наборе данных, то есть декартовы координаты и таймфрейм.

Далее вычтите фон из интересующей области. Чтобы не потерять ячейку при устранении фона, выберите самую большую сферу, которая помещается в объект. Теперь разделите соединенные объекты, выбрав диаметр исходной точки, и перейдите к классификации всех исходных точек.

Следующим шагом является классификация поверхности Сейчас вручную. Группируйте исходные точки, указывающие на один и тот же объект. Сделайте это между всеми временными точками в области интереса.

Наконец, отслеживайте объекты после завершения отслеживания, классифицируйте треки объектов, а затем выводите набор количественных данных для анализа с помощью электронной таблицы. После нескольких дней концентрических гелевых культур клетки нарушили внутреннюю внешнюю границу гелевого поля и начали проникать во внешний гель. Популяция клеток распространяется наружу преимущественно в радиальном направлении.

Сравнивали движение клеток во внешнем геле различной плотности коллагена. Визуализация проводилась в течение восьми часов, и для каждого образца было рассчитано около 200 траекторий клеток. Клетки в самом тонком матриксе перемещались на наименьшее расстояние.

Этот расчет учитывал все клетки, а не только клетки, мигрирующие радиально наружу. Во всех случаях общее пройденное расстояние было больше, чем чистое водоизмещение. В качестве ожидаемой стойкости рассчитывалась как отношение между смещением и расстоянием.

Значение персистенции 0,4 предполагает, что эти клетки имели по своей природе слабую направленную миграцию. Расчеты средней скорости показали, что плотность коллагена не влияет на скорость клеток. Возможно, что размер пор матрикса и плотность коллагена, которые находятся в обратной зависимости, оказывали противоположное влияние на скорость миграции и таким образом компенсировали друг друга.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как построить концентрическую гелевую систему и как изучить эту миграцию клеток в 3D-среде. Следуя этой процедуре, вы можете сделать много других вещей, таких как экстракция клеток, анализ микрочипов, где вы можете попытаться ответить на дополнительные вопросы, например, сколько определенных белков экспрессируется в разные временные точки миграции.