Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

Общая цель следующего эксперимента заключается в наблюдении за ролью механического напряжения в механобиологии клеток в режиме, близком к реальному времени. Для этого сначала создается система с гибкими мембранами, на которых выращивают и растягивают клетки. На втором этапе мембрана растягивается для калибровки показаний двигателя относительно степени деформации мембраны.

Затем эпителиальные клетки легких мыши подвергаются растяжению, и проводится визуализация ядер. Чтобы показать, что деформация мембраны передается клеткам, растяжители были интегрированы в А FM для наноиндентации с целью измерения жесткости отдельных клеток до и после растяжения. Результаты демонстрируют прямое повреждение клеток вследствие приложенного растяжения.

Кроме того, данные флуоресцентной визуализации показывают, что продукция активных форм кислорода увеличивается при растяжении. Таким образом, данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области механобиологии легких, например, могут ли эпителиальные клетки быть повреждены при искусственной вентиляции легких. Этот метод позволяет глубже понять механобиологию клеток легких, а также может быть применен к другим мягким тканям, таким как срезы печени или пластинок роста.

Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с определенными трудностями из-за использования в этих экспериментах нетрадиционной комбинации инструментов, таких как атомно-силовой микроскоп. Для начала подготовьте мембрану из PDMS с коллагеновым покрытием, модифицированную для использования в культуре клеток, согласно описанию в прилагаемом текстовом протоколе. Затем произведите посев эпителиальных клеток легкого мыши на стерильную гибкую мембрану с коллагеновым покрытием из расчета 2,5 million cells на лунку.

Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение двух дней до достижения клетками полной конфлюэнтности. Затем с помощью биопсийного просекателя диаметром 1,5 мм проделайте по два отверстия в каждой из шести зажимных вкладок на расстоянии 20,5 мм от центра конструкции, если предварительное натяжение не требуется. После этого удалите питательную среду для культур клеток.

Убедитесь, что механический актуатор находится в положении нулевой деформации, и разместите мембрану на растягивателе так, чтобы перфорационные отверстия совпадали с закрепляющими штифтами и зажимами. Установите верхние зажимы, затем поочередно затяните винты с разных сторон. Добавьте 1 mL среды для культивирования клеток, прежде чем поместить устройство на предметный столик микроскопа.

Разместите устройство по центру светового пути. Затем закрепите устройство на предметном столике. Сфокусируйтесь на мембране, регулируя горизонтальное и вертикальное положение механического устройства с помощью контроллера столика микроскопа в соответствующем блоке ввода.

Введите значение счета двигателя, соответствующее желаемому уровню деформации. Затем установите значение в блоке ввода скорости на 10 RPM или меньше, чтобы наблюдать за одной и той же областью до и после растяжения, так как поле может сместиться относительно объектива микроскопа, и в процессе растяжения может потребоваться регулировка предметного столика микроскопа. После того как все настройки будут заданы, нажмите кнопку «go».

Начните с настройки атомно-силового микроскопа. Поднимите головку АСМ в направлении оси Z до максимального положения. Затем установите удлинители на ножки, чтобы поднять плоскость контакта кантилевера АСМ с образцом.

Затем снимите с микроскопа пластину сканера A FM и выбранный объектив. Установите на объектив проставочное кольцо, после чего закрепите его обратно в микроскопе. Затем установите пластину сканера обратно на A FM. Высота проставочного кольца зависит от объектива и конкретной настройки A FM, однако использование кольца необходимо при планируемой оптической визуализации, так как плоскость наблюдения будет смещена по оси Z.

Затем запустите программное обеспечение А FM, программное обеспечение оптического микроскопа и все необходимые источники света, включая источник света для флуоресцентных измерений. Установите на А FM чип с кантилевером, жесткость которого составляет 200 pico newtons per nanometers или меньше, для измерения модуля упругости живых клеток. Затем юстируйте лазер, после чего установите на устройство покровное стекло и используйте его для калибровки жесткости кантилевера согласно рекомендациям производителя. Непосредственно перед закреплением мембраны в устройстве для растяжения обрежьте стенки до высоты примерно один миллиметр.

Это снижает уровень помех, возникающих между стенками мембраны и тензодатчиком. Затем удалите среду для культивирования клеток и установите мембрану на механическое устройство. С помощью программного обеспечения установите механическое устройство с адаптером на сканер.

Перед проведением наноиндентации растяните мембрану до требуемого уровня осевого растяжения. Добавьте на клетки не более 0,5 мл среды для поддержания их гидратации, стараясь не допустить пролива жидкости, который может привести к повреждению сканера FM или микроскопа. Затем приведите кантилевер в контакт с мембраной.

Следуйте протоколу конкретного устройства АСМ для сканирования интересующих областей. Когда к клеткам, высеянным на мембране, прикладывали деформацию 20%, клетки смещались на 20%, как показано здесь; влияние клеток на выработку активных форм кислорода в бронхиальных эпителиальных клетках измеряли с помощью кумулятивного сенсора митохондриального супероксида, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. В отсутствие механического растяжения выработка АФК существенно не увеличивалась в течение 60 минут при однократном приложении и поддержании растяжения 17%.

При использовании механического растяжителя, интегрированного в атомно-силовой микроскоп, наблюдалось увеличение продукции митохондриальных АФК, которое сохранялось в течение еще 60 минут. Карты модуля упругости эпителиальных клеток легких мыши до и после применения растяжения 10% были получены из выделенных здесь областей. Было зарегистрировано 300 индивидуальных кривых принудительного отклонения на участке размером 40 на 40 мкм, что продемонстрировало изменение локализации областей с высоким модулем упругости при приложении растяжения.

После освоения метода растяжение клеток может быть выполнено за 15 минут. В то время как наноиндентация с использованием FM может занять два часа при правильном выполнении. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости бережного, но быстрого обращения с клетками, так как на результаты могут негативно повлиять механическое воздействие и длительное воздействие комнатного воздуха до регистрации данных. Не забывайте, что работа с FM может быть крайне сложной.

При выполнении данной процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как недопущение попадания любых жидкостей на сканер.