Живых изображений сотовый процессе механической Stretch

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы наблюдать роль механического напряжения в механобиологии клеток в режиме, близком к реальному времени. Это достигается путем создания системы с гибкими мембранами, на которых клетки выращиваются и растягиваются. В качестве второго шага растяните мембрану для калибровки количества моторов с нагрузкой мембраны.

Затем эпителиальные клетки легких мыши растягиваются и визуализируются ядра. Чтобы показать, что деформация мембраны передается клеткам, растяжители затем были включены в A FM для наноиндентирования, чтобы измерить жесткость отдельных клеток до и после растяжения. Результаты показывают прямое повреждение клеток из-за примененного растяжения.

Также на основе флуоресцентной визуализации показано, что производство активных форм кислорода увеличивается при растяжении. Что ж, этот метод может ответить на ключевые вопросы в области механической биологии легких, например, можно ли повредить эпителиальные клетки с помощью искусственной вентиляции легких. Этот метод может дать представление о клетках легких, механической биологии, а также может быть применен к другим мягким тканям, таким как срезы печени или пластины роста.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за нетрадиционной комбинации инструментов, используемых в этих экспериментах, таких как атомно-силовой микроскоп. Для начала приготовьте мембрану PDMS, покрытую коллагеном, модифицированную для использования в клеточной культуре, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем засейте эпителиальные клетки легких мыши в количестве 2,5 миллионов клеток на лунку на стерильную, гибкую мембрану, покрытую коллагеном.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение двух дней, пока клетки не достигнут плавности. Затем с помощью 1,5-миллиметрового пробойника для биопсии проделайте по два отверстия в каждом из шести зажимных выступов, на расстоянии 20,5 миллиметров от центра конструкции, если предварительное натяжение не требуется. И удалите среды для клеточных культур.

Убедитесь, что механический привод находится в положении нулевой нагрузки, и расположите мембрану на носилке так, чтобы отверстия для пробивки совпадали со штифтами и зажимами. Установите верхние зажимы на место, а затем затягивайте винты по одному, чередуя разные стороны. Добавьте один миллилитр среды для клеточных культур перед тем, как поместить устройство на предметный столик для микроскопа.

Центрируйте устройство на световом тракте. Далее закрепите устройство на сцене. Фокусировка на мембране осуществляется путем регулировки положения механического устройства в плоскости и вертикали с помощью контроллера предметного стекла микроскопа в блоке ввода назначения.

Введите значение количества двигателей, которое соответствует требуемому приложенному уровню деформации. Затем установите значение в блоке ввода скорости на 10 оборотов в минуту или меньше, чтобы наблюдать одно и то же поле до и после растяжения, поскольку поле может смещаться относительно объектива микроскопа, и может потребоваться регулировка предметного столика микроскопа во время растяжения. Как только все будет готово, нажмите кнопку «Начать».

Начните с корректировки атомно-силового микроскопа. Увеличьте высоту головки FM до ее максимального положения в направлении Z. Затем наденьте на ноги удлинители, чтобы поднять плоскость, в которой FM-кантилевер соприкасается с образцом.

Далее извлеките из микроскопа пластину сканера A FM и нужный объектив. Добавьте спейсер к объективу, а затем установите его обратно на микроскоп. Затем поместите пластину сканера обратно на A FM. Высота спейсера будет зависеть от объектива и конкретной FM-установки, но необходимо использовать спейсер, если требуется оптическое изображение, поскольку план наблюдения будет смещен в направлении Z.

Затем запустите программное обеспечение A FM, программное обеспечение оптического микроскопа и все необходимые источники света, включая источник света для измерения флуоресценции. Установите чип с консольным лучом с жесткостью 200 пиконьютонов на нанометр или менее для измерения модуля упругости живых клеток на A FM. Затем выровняйте лазер, затем установите на прибор стеклянную крышку и с его помощью откалибруйте жесткость кантилевера в соответствии с предложениями производителя. Непосредственно перед монтажом мембраны на натяжное устройство обрежьте стенки примерно до одного миллиметра в высоту.

Это снижает помехи, возникающие между стенками мембраны и тензодатчиком. Затем удалите питательную среду для клеточных клеток и установите мембрану на механическое устройство. Установите механическое устройство с адаптером на сканер с помощью программного обеспечения.

Растяните мембрану до желаемого уровня деформации при растяжении перед наноиндентированием. Добавьте 0,5 миллилитра или меньше среды в клетки, чтобы сохранить их увлажненными, но также следите за тем, чтобы не пролить жидкость, которая может повредить FM-сканер или микроскоп. Затем зацепите консольную балку с мембраной.

Следуйте протоколу конкретного FM-устройства A для сканирования интересующих областей. Когда 20%-ный штамм был применен к клеткам, посеянным на мембране, клетки сместились на 20%, как показано здесь, влияние клеток на производство активных форм кислорода было измерено в бронхиальных эпителиальных клетках с использованием кумулятивного митохондриального супероксидного сенсора, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. При отсутствии механического растяжения производительность АФК существенно не увеличивалась в течение 60 минут при нанесении и поддержании одного 17%-ного растяжения.

Наблюдалось увеличение митохондриального АФК, которое сохранялось еще 60 минут после включения механического растяжителя в атомно-силовой микроскоп. Модуль эластики, карты эпителиальных клеток легких мыши до и после 10%-ной деформации на растяжение были получены из областей, описанных здесь. Было зарегистрировано 300 отдельных кривых вынужденного прогиба в области 40 на 40 мкм, показывающих изменение локализации высокомодульных областей с приложением деформации.

После освоения растяжку клеток можно делать за 15 минут. В то время как FM-наноиндентирование может занять два часа для правильной работы При попытке выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с клетками, но быстро, так как на результаты может негативно повлиять перемешивание и длительное воздействие воздуха в помещении до того, как данные будут сообщены. Не забывайте, что работа с FM может быть чрезвычайно сложной.

При выполнении этой процедуры необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как удаление всех жидкостей из сканера.