В естественных изображений и слежения за технеция-99m меченого костного мозга мезенхимальных стволовых клеток в Коневодство Tendinopathy
9 декабря 2015 г.
Этот протокол описывает радиоактивное мечение мезенхимальных стволовых клеток лошадей и их имплантацию в травмы сухожилий у лошади с целью определения выживаемости клеток и распределения тканей с помощью гамма-сцинтиграфии.
Общая цель данного протокола заключается в неинвазивном отслеживании распределения и дальнейшей судьбы меченых мезенхимальных стволовых клеток костного мозга после их введения с помощью гамма-сцинтиграфии. Судьба стволовых клеток после инъекции изучена недостаточно. Основными преимуществами этого метода являются возможность неинвазивного мониторинга перемещения стволовых клеток в различные органы после введения, а также короткий период полураспада A osteo, что обеспечивает его выведение из организма к 48 часам.
Хотя это позволило глубже понять возможности применения стволовых клеток при терапии естественным образом возникших тендинопатий, данный метод также может быть использован для исследования способов лечения заболеваний костной ткани и сердца. Как правило, основные сложности для лиц, впервые применяющих данный метод, заключаются в координации клеток, подготовке набора для маркировки и подготовке пациента. Для непосредственного введения клеток начните с нанесения акустического контактного геля на зафиксированную конечность, затем с помощью линейного датчика проведите систематическое сканирование всей области ладонной поверхности пястных костей для получения серии поперечных и продольных изображений с целью определения зоны максимального повреждения.
После введения местного анестетика обработайте место имплантации хирургическим раствором хлоргексидина в течение не менее пяти минут, после чего протрите кожу марлей, смоченной в этаноле. После подготовки животного наденьте пару перчаток, затем центрифугируйте аликвоту костного мозга, содержащую 1 × 10⁷ мезенхимальных стволовых клеток, в 1 мл супернатанта костного мозга до образования осадка. Затем аспирируйте супернатант с помощью шприца объемом 2 мл, оснащенного иглой 18 или 19 gauge, оставив в пробирке примерно 100 µL раствора.
Перенесите супернатант в микроцентрифужную пробирку на льду, затем осторожно встряхните пробирку, чтобы ресуспендировать клетки в оставшихся 100 µL супернатанта. Убедитесь, что клетки полностью ресуспендированы и видимые скопления ткани отсутствуют. После этого выдержите клетки при комнатной температуре.
Теперь смешайте один миллилитр технеция Protec nutate в пробирке с H-M-P-A-O. Через пять минут с помощью шприца объемом один миллилитр и иглы обработайте мезенхимальные стволовые клетки всей аликвотой TECHNETIUM 99 M-H-M-P-A-O. Затем закройте пробирку крышкой, перемешайте клетки легким постукиванием и поместите пробирку при комнатной температуре за свинцовый экран.
Через 30 минут откройте пробирку с помощью пинцета и с помощью миллилитрового шприца, оснащенного иглой 21 G, добавьте к клеткам 1 mL PBS. Закройте пробирку и перемешайте клетки. Затем центрифугируйте клетки и с помощью двухмиллилитрового шприца осторожно перенесите супернатант в соответствующую защитную пробирку с маркировкой «wash one».
Затем промойте осадок в еще одном миллилитре PBS, как было продемонстрировано выше. После второго промывания перенесите раствор в соответствующую маркированную пробирку W2. Тщательно ресуспендируйте клетки в остатках PBS и добавьте аликвоту ледяного супернатанта костного мозга, удерживая трансдьюсер параллельно игле.
Медленно введите иглу 20G длиной 1,5 или 2 дюйма в зону максимального повреждения в центре очага поражения в продольной ориентации. Затем, используя соответствующий экран, аспирируйте клетки в шприц Luer-Lock объемом 2 мл, оснащенный иглой 20G, и удалите иглу, стараясь не допустить потери жидкости. После присоединения шприца к предварительно установленной в сухожилии игле расположите ультразвуковой датчик под иглой так, чтобы траектория иглы в ткани была четко видна, и медленно, но равномерно введите клетки в очаг поражения.
Убедитесь, что жидкость, вводимая в очаг поражения, видна на ультразвуковом изображении как гипоэхогенная жидкость, содержащая гиперэхогенные пузырьки воздуха; после введения всех клеток извлеките иглу. Используйте функции acquire study selection и bone static в программном обеспечении для обработки, чтобы получить статические изображения с экспозицией 60 секунд для каждого. Затем в указанное время получите латеральные изображения области очага поражения от запястья до дистального конца конечности, аналогичной области противоположной конечности, левого легочного поля и левой щитовидной железы.
Затем выберите инструменты выделения области интереса и эллипса и при необходимости измените форму маски выделения поверх области поражения. Наконец, выберите опцию добавления двух статистических показателей, чтобы получить количество объектов в области интереса. Следите за тем, чтобы для каждого животного в разные моменты времени фиксировались области интереса одинакового размера.
После внутриочагового введения клетки будут наблюдаться в виде фокальной зоны сигнала с ограниченным распространением клеток в окружающую ткань сухожилия с течением времени. Напротив, при введении клеток путем региональной перфузии через пальцевую вену Палмера в месте инъекции наблюдается постепенное снижение интенсивности сигнала. Как правило, после внутриочаговой инъекции легочные поля остаются отрицательными, однако на ранних временных точках иногда может обнаруживаться очень локальный сигнал, который со временем становится более генерализованным.
При данном пути введения щитовидная железа также остается негативной. Регионарная перфузия также демонстрирует очаговый сигнал в легких, который со временем становится более диффузным, хотя сигнал значительно более интенсивный по сравнению с тем, что наблюдалось при внутриочаговом пути введения. При щитовидной железе, также часто проявляющей очаговый сигнал, общее начальное количество радиоизотопа в клетках в момент времени ноль до инъекции, а также показатели начальной гамма-граммы в области интереса.
Значения в момент времени ноль после инъекции могут быть использованы для расчета процента снижения количества импульсов в каждой временной точке после введения, чтобы определить прогнозируемый распад TC 99 M относительно начальных показателей. Затем можно также рассчитать количество клеток, сохранившихся в месте инъекции в каждый момент времени после введения. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие пути введения клеток для поиска ответов на дополнительные вопросы о способности мезенхимальных стволовых клеток к хомингу после их развития.
Данный метод открыл исследователям в области региональной медицины путь к изучению способов улучшения удержания клеток в местах повреждений сухожилий. После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как маркировать клетки и регистрировать их распределение и концентрацию в различных системах органов. Не забывайте, что работа с ионизирующим излучением может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать меры предосторожности, такие как использование средств индивидуальной защиты, дозиметров, свинцового экранирования, а также правильная утилизация радиоактивных отходов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод неинвазивного отслеживания мезенхимальных стволовых клеток лошадей после их имплантации в область повреждения сухожилий с помощью гамма-сцинтиграфии. Этот метод позволяет оценить выживаемость клеток и их распределение в тканях с течением времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Терапия стволовыми клетками
- Ветеринарная медицина
- Методы визуализации
Теоретическая часть
- Судьба стволовых клеток после инъекции изучена недостаточно.
- Гамма-сцинтиграфия позволяет неинвазивно отслеживать стволовые клетки.
- Данный метод имеет важное значение для лечения тендинопатий и других заболеваний.
- К основным сложностям относятся правильная координация клеток и подготовка пациента.
Цель исследования
- Отслеживание распределения и судьбы меченых мезенхимальных стволовых клеток.
- Углубление понимания поведения стволовых клеток in vivo.
- Изучение потенциальных возможностей применения в различных терапевтических целях.
Используемые методы
- Нанесение акустического контактного геля на конечность.
- Использование линейного датчика для визуализации.
- Систематическое сканирование ладонной области пястных костей.
- Определение зоны максимального повреждения с помощью визуализации.
Основные результаты
- Успешное отслеживание стволовых клеток в нескольких органах.
- Представление о выживаемости и распределении стволовых клеток после имплантации.
- Демонстрация возможности применения гамма-сцинтиграфии в ветеринарии.
- Создание базы для дальнейших исследований в области терапии стволовыми клетками.
Выводы
- Данный протокол позволяет осуществлять эффективный мониторинг терапии стволовыми клетками.
- Гамма-сцинтиграфия является ценным инструментом в ветеринарной медицине.
- Необходимы дальнейшие исследования для изучения более широких возможностей применения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Неинвазивное отслеживание судьбы стволовых клеток устраняет критический пробел в развитии регенеративной медицины, обеспечивая количественную оценку удержания и биораспределения клеток. Эта возможность способствует снижению механистических рисков в доклинических исследованиях терапии стволовыми клетками за счет выяснения кинетики выживаемости на ранних этапах и закономерностей миграции в нецелевые зоны. Для моделей повреждения сухожилий у лошадей и трансляционных моделей такая визуализация позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований, связывая персистенцию клеток с функциональными результатами.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественной оценки удержания стволовых клеток в местах повреждения по сравнению с их выведением в такие органы, как легкие и щитовидная железа.
- Практическая ценность: обеспечивает получение воспроизводимых данных о биораспределении с помощью гамма-сцинтиграфии для сравнения путей введения, таких как интралезиональное введение в сравнении с регионарной перфузией.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные измерения зависимой переменной (гамма-импульсы в стандартизированных областях интереса) для оценки эффективности мечения клеток и их краткосрочной выживаемости.
- Практическая ценность: Устанавливает стандартизированный рабочий процесс радиоактивного мечения мезенхимальных стволовых клеток с помощью Tc-99m HMPAO, обеспечивая готовность анализа для проведения сравнительных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает валидацию системы в контексте соответствующего заболевания путем отслеживания выживаемости клеток в течение 36 часов после имплантации при тендинопатии лошадей, что позволяет уточнить вопросы дозирования и сроков введения.
- Практическая ценность: Способствует кросс-функциональному сотрудничеству за счет стандартизированного анализа выбранных областей интереса и требований к воспроизводимости для лонгитюдных точек визуализации.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Этот метод визуализации вписывается в общую последовательность этапов исследования — от ранней валидации мишени до доклинической оценки, предоставляя количественные данные о биораспределении, которые помогают определить приоритетные стратегии доставки стволовых клеток перед тестированием функциональной эффективности.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез, позволяя визуализировать судьбу стволовых клеток и количественно оценивать удержание в месте поражения по сравнению с захватом легкими или щитовидной железой.
- Скрининг: Предоставляет стандартизированные количественные результаты анализа (подсчет в области интереса), что позволяет сравнивать жизнеспособность клеток при различных условиях манипуляции или доставки.
- Аналитика: Позволяет рассчитывать процент снижения сигнала с течением времени, чтобы отличить распад радиометки от биологического клиренса, что помогает в кинетическом моделировании.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о раннем приживлении с доклинической непрерывностью путем определения оптимальных окон для оценки функционального восстановления в моделях повреждения сухожилий.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу неинвазивной визуализации, применимую для исследований стволовых клеток в различных тканевых контекстах, включая модели заболеваний костей и сердца.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает неопределенность механизмов терапии стволовыми клетками, предоставляя прямые доказательства биораспределения и кинетики раннего выживания.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов промывки, мечения и визуализации клеток с использованием свинцового экранирования при работе.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки ранней потери клеток (удержание <10%) и паттернов органоспецифического биораспределения.
- Влияние на портфель проектов: Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении, уточняя, коррелируют ли наблюдаемые терапевтические эффекты с устойчивым локальным приживлением или с транзиторной паракринной активностью.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области радиофармации и навыки безопасного обращения с Tc-99m в соответствии с протоколами радиационной безопасности.
- Необходимо наличие оборудования для гамма-сцинтиграфии и рабочих зон с свинцовым экранированием для проведения процедур мечения клеток и инъекций.
- Требуется стандартизация взаимодействия между группами по подготовке клеток, визуализации и ветеринарной хирургии для обеспечения согласованного определения областей интереса.
- При переносе данных об эффективности мечения с МСК лошадей на другие виды или источники клеток следует учитывать необходимость адаптации методики.
- Возможно только краткосрочное отслеживание (до 36 часов) из-за 6-часового периода полураспада Tc-99m, что ограничивает возможность оценки долгосрочного приживления клеток по истечении этого времени.
