Выявление заболевания, связанного α-синуклеина-повышенной ELISA в мозге трансгенных мышей с гиперэкспрессией Human A53T Мутация α-синуклеина
30 мая 2015 г.
Описан метод ELISA, предлагающий новый количественный подход. Он специфически обнаруживает связанный с заболеванием α-синуклеин (αSD) в трансгенной модели мыши (M83) синуклейнопатии с использованием нескольких антител, направленных либо против фосфорилированной в положении Ser129 формы αS, либо против С-концевой части белка.
Общая цель следующего эксперимента - контроль накопления связанного с болезнью альфа-синуклеина в трансгенной модели болезни Паркинсона с использованием количественного подхода Элиза. Это достигается путем либо нормального старения не инфицированных мышей, либо интрацеребрального введения мышам экстракта из мозга больной мыши M 83. После того, как мыши развивают клиническую болезнь и их усыпляют, из мозга мышей выделяют мозговые регионы.
Далее гомогенизированные образцы из каждого мозгового региона готовятся в буфере с высоким содержанием соли, и на гомогенатах проводится Элиза с целью количественной оценки альфа-синуклеина, связанного с болезнью, в каждом мозговом регионе. Результаты Элизы показывают, что болезни связанная форма альфа-синуклеина в основном накапливается в центральных мозговых регионах, включая мезенцефал и ствол мозга, а также в спинном мозге мышей. Основное преимущество этого метода Элиза по сравнению с ранее доступными методами, такими как западный блот или иммуногистохимия, заключается в том, что он обеспечивает быструю и надежную количественную оценку связанного с болезнью альфа-синуклеина.
В этой экспериментальной модели этот метод может помочь в контроле накопления и распространения этого белка в центральной нервной системе мыши M 83. Это предполагает участие механизма, подобного мозговому, до развития клинической болезни. В будущем можно рассмотреть дальнейшее развитие этого метода для исследования различных биологических образцов, таких как спинномозговая жидкость или кровь, которые, возможно, также содержат измененные альфа-формы, что демонстрирует, что эта процедура будет выполняться техником из нашей лаборатории.
Все процедуры и протоколы, включающие животных, были в соответствии с директивой ЕС 86 6 0 9 ЕЭК и утверждены французским Национальным комитетом по этике и экспериментам на животных. Для рассмотрения вопросов этики и экспериментов на животных, животные содержались и за ними ухаживали в одобренных экспериментальных учреждениях в Леоне Янге после эвтаназии мышей и извлечения мозга и спинного мозга. В соответствии с текстом протокола, поместите целый мозг в чашку Петри на лед под слабым увеличением.
Начните с отделения одного из двух обонятельных ядер, поместив пинцет прямо за ядром. Используя движение вниз, отделите его от мозга, затем удаляйте второе ядро аналогичным образом. Теперь, используя пинцеты, чтобы держать мозг на месте, аккуратно вставьте вторую пару пинцет между левым и правым кортексами и двигайте их вперед, чтобы разделить две половинки.
Теперь, продолжая держать мозг на месте. Расположите второй пинцет в двух миллиметрах за кортексом и поддерживайте давление вверх, чтобы поднять кортекс с гипокампа. Затем отделите первую часть кортекса, начиная с гипокампа и двигаясь к передней части мозга.
Повторите с второй половинкой. Затем расположите открытый пинцет вокруг одного из гипокампов. Затем аккуратно закройте пинцеты на дне органа и аккуратно удалите его.
Повторите с вторым гипокампом. Расположите пинцеты за одной из стрии и аккуратно отделите ее от мозга. Используйте пинцеты, чтобы удалить любой оставшийся кортекс из стрии, прежде чем удалить второй стрии, чтобы отделить мозжечок от остальной части мозга с помощью пинцетов, аккуратно подавите контур мозжечка.
Затем поместите пинцеты за мозжечком и двигайте пинцеты вперед, чтобы удалить его, используя широкую часть пинцетов, подняв их, как цефалон, который состоит из четырех круглых структур, чтобы ясно видеть, где соединяется ствол мозга. Затем сделайте вертикальный разрез на соединении, прежде чем удалить ствол мозга, расположите пинцеты за мезенцефалоном и по вертикали, чтобы полностью отделить его от оставшейся части мозга. Для приготовления гомогената мозга добавьте достаточный объем буфера HS к разрезанным мозговым регионам, чтобы достичь ожидаемого процента гомогената, как показано в таблице ниже.
Используя тканевой измельчитель, состоящий из стеклосиликатной трубки и пестиков A и B, влейте область мозга, которую необходимо размять, в трубку. Затем с помощью пестика гомогенизатора проведи гомогенизацию 10 раз, чтобы разделить ткань. Затем переключитесь на пестик B и проведите дополнительную гомогенизацию 20 раз.
С помощью переливательной пипетки перенесите гомогенат в 1,5-миллиметровую пробирку, повторяя гомогенизацию с оставшимися образцами мозга. Центрифугируйте образцы при 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, а затем собирайте снаты и делите их на 200 микролитров. Али Ватты. Храните при минус 80 градусах Цельсия для последующего анализа Элиза, чтобы провести Элиза на мозговом го
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен новый количественный метод ИФА для обнаружения ассоциированного с заболеванием α-синуклеина в трансгенной мышиной модели синуклеинопатии. Этот метод позволяет контролировать накопление α-синуклеина в различных областях мозга по мере прогрессирования заболевания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биохимия
- Трансгенные модели
Описание метода
- α-synuclein участвует в развитии синуклеинопатий, таких как болезнь Паркинсона.
- Традиционные методы, такие как вестерн-блоттинг и иммуногистохимия, имеют ограничения в области количественного анализа.
- ELISA представляет собой быстрый и надежный альтернативный метод количественного определения белка.
- Трансгенная модель мышей M83 используется для изучения прогрессирования заболевания.
Цель исследования
- Количественно определить накопление ассоциированного с заболеванием α-synuclein в конкретных областях мозга.
- Сравнить эффективность метода ELISA с традиционными методами.
- Углубить понимание распределения α-synuclein при синуклеинопатии.
Используемые методы
- Трансгенным мышам не вводили инокулят либо вводили экстракты мозга.
- Мышам давали время на старение или развитие клинических признаков заболевания перед усыплением.
- Области мозга выделяли и гомогенизировали в буфере с высоким содержанием соли.
- Проводили анализ ELISA для количественного определения уровней α-synuclein в образцах.
Основные результаты
- В каудальных отделах мозга наблюдалось значительное накопление ассоциированного с заболеванием α-синуклеина.
- Высокие уровни были обнаружены в среднем мозге, стволе мозга и спинном мозге.
- Метод ELISA обеспечил быстрое и надежное количественное определение по сравнению с традиционными методами.
- Полученные результаты подтверждают применимость ELISA для изучения α-синуклеина при синуклеинопатиях.
Выводы
- Новый метод ELISA эффективен для количественного определения α-synuclein в трансгенных моделях.
- Данный подход может способствовать дальнейшим исследованиям синуклеинопатий.
- Будущие исследования могут быть направлены на изучение терапевтических вмешательств, нацеленных на подавление накопления α-synuclein.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Количественное определение ассоциированного с заболеванием α-синуклеина имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в процессе разработки препаратов для лечения синуклеинопатий. Подход на основе метода ELISA обеспечивает быстрое и надежное количественное определение в различных областях мозга, что помогает принимать решения о продолжении или прекращении доклинических программ. Данный метод повышает прогностическую достоверность, обеспечивая масштабируемые и воспроизводимые результаты для механистических исследований и мониторинга терапевтического воздействия.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать патологию α-synuclein как терапевтическую мишень в моделях болезни Паркинсона.
- Операционная ценность: обеспечивает количественные показатели на основе специфических антител для уточнения степени воздействия на мишень и модуляции сигнальных путей.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков путем установления корреляции между накоплением молекул и фенотипическим прогрессированием заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированное, совместимое с высокопроизводительным анализом количественное определение α-synuclein, связанного с заболеванием.
- Практическая ценность: Для детекции требуется всего 10 μg эквивалента ткани мозга, что повышает эффективность анализа по сравнению с вестерн-блоттингом.
- Воспроизводимость: Демонстрирует стабильные результаты при различных условиях инокуляции и старения, что позволяет проводить надежный лонгитюдный мониторинг.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Облегчает мониторинг прионного распространения в ЦНС, что позволяет уточнять механистические модели распространения заболевания.
- Операционная ценность: Позволяет выявлять накопление белков в каудальных областях мозга и спинном мозге, что согласуется с клинической патологией.
- Трансляционная ценность: Способствует квалификации биомаркеров, обеспечивая количественные показатели белков, связанных с заболеванием.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод ELISA вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до доклинических испытаний эффективности, позволяя проводить итерационную оценку соединений, модулирующих α-synuclein.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез об агрегации α-синуклеина и нейротоксичности в трансгенных моделях.
- Скрининг: Позволяет создавать готовые к анализу биологические системы с количественными показателями для оценки библиотек соединений.
- Аналитика: Обеспечивает считывание показателей абсорбции при 450 nm, что позволяет проводить статистическое сравнение эффектов воздействия в различных областях мозга.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярную детекцию с фенотипическими результатами, поддерживая принятие решений о продвижении исследований с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированную платформу для количественного определения α-синуклеина, применимую к нескольким моделям заболеваний и терапевтическим модальностям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишени за счет специфического количественного определения α-синуклеина, связанного с заболеванием.
- Операционная ценность: Обеспечивает получение быстрых результатов (в течение нескольких часов) по сравнению с несколькими днями для вестерн-блоттинга, что ускоряет сроки реализации проекта.
- Стратегическая ценность: Снижает риск неудач на поздних этапах, позволяя принимать ранние решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») на основе механизмов действия.
- Влияние на портфель: Повышает эффективность использования капитала за счет приоритизации соединений с доказанным взаимодействием с мишенью in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области оптимизации ELISA, валидации антител и гомогенизации тканей головного мозга.
- Зависит от приготовления буфера с высокой концентрацией соли и наличия микропланшетного ридера для измерения оптической плотности.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия при подготовке образцов и соблюдения протоколов инкубации.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать валидации специфичности антител и доступности эпитопа.
- Практическое ограничение: детектирование сигнала зависит от достаточного накопления ассоциированного с заболеванием α-synuclein, которое может варьироваться в зависимости от модели и возраста.
