Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в создании функциональной системы TED у zebrafish для достижения условной тканеспецифичной экспрессии генов, что продемонстрировано на примере регенерирующего хвостового плавника в данном видео. Это реализуется путем первоначального создания трансгенных линий с Tet-активатором, которые экспрессируют тетрациклин-индуцибельный транскрипционный активатор, меченный am cyan в интересующей ткани, и линий с Tet-респондентом, содержащих ген интереса с меткой ype под контролем Tet-респонсивных элементов. Затем создаются специфические комбинации двойных трансгенных рыб Tet-активатор/Tet-респондент.

Затем экспрессия тканеспецифичного Tet-респондентного трансгена индуцируется путем введения доксициклина. В завершение экспрессия Tet-респондентного трансгена подтверждается путем подготовки срезов тканей регенерирующих плавников. В конечном итоге для визуализации тканеспецифичной экспрессии Tet-респондентного трансгена используется иммунофлуоресценция.

Основным преимуществом данной методики перед другими методами, такими как экспрессия генов, индуцированная тепловым шоком, является то, что эта система позволяет осуществлять индуцибельную и обратимую экспрессию генов тканеспецифичным образом. Данный метод может способствовать более глубокому пониманию молекулярных сигнальных сетей, управляющих регенерацией плавников у рыб, поскольку он позволяет анализировать сигнальный путь и функцию генов в отдельных тканях. Несмотря на то, что мы используем эту технологию для изучения регенерации плавников Danio rerio, она может быть полезна и во многих других ситуациях, требующих тканеспецифичного манипулирования функцией генов.

После получения линий рыб-респондеров Tet в соответствии с текстовым протоколом оцените интеграцию трансгена в зародышевую линию и его индуцибельность путем скрещивания отдельных рыб поколения G0 с ранее созданной линией активаторов Tet. Затем соберите эмбрионы и вырастите их до стадии, на которой можно оценить индукцию Tet-респондера. Приготовьте 2000-кратный стоковый раствор доксициклина, используя 50% ethanol для растворения доксициклина до достижения концентрации 50 mg/mL.

Храните аликвоты docks в защищенном от света месте при температуре -20 °C. Затем приготовьте среду для эмбрионов E3, содержащую docks в конечной концентрации 25 µg/mL. После этого слейте большую часть среды E3 с эмбрионов.

Замените среду на раствор, содержащий среду E3, и верните эмбрионы при температуре 28.5 °C минимум на шесть часов. После инкубации с помощью флуоресцентного стереомикроскопа проведите скрининг эмбрионов на наличие флуоресценции Ypet. На основе выявленных основателей создайте несколько стабильных трансгенных линий Tet-респондеров.

Выбирайте линии, которые демонстрируют сильную индукцию и минимальный мозаицизм в ожидаемой области экспрессии, а также gering вариабельность между отдельными эмбрионами. После создания линий рыб с активатором TED и респондером Tet, скрестите носителей активатора Tet с носителями респондера Tet для получения двойных трансгеников. Отберите эмбрионы, несущие трансген активатора Tet, путем скрининга на наличие флуоресценции am cyan под стереомикроскопом, и вырастите положительные по am cyan эмбрионы до взрослого состояния.

Идентифицируйте взрослых рыб с двойным трансгенезом, несущих Tet-респондер в дополнение к Tet-активатору, с помощью генотипирования методом ПЦР или по их способности индуцировать экспрессию Tet-респондера в интересующей ткани, чтобы провести окрашивание хвостового плавника. Анестезируйте взрослых zebrafish в стакане с рыбной водой, содержащей 160 µg/mL трикаина. Когда рыба перестанет двигаться, с помощью пинцета осторожно перенесите ее на перевернутую чашку Петри и с помощью скальпеля выполните частичную ампутацию хвостового плавника для последующей обработки доксициклином. Подготовьте боксы для разведения с одним литром системной рыбной воды, содержащей 25 µg/mL доксициклина.

В качестве отрицательного контроля добавьте 250 µL этанола вместо доксициклина в нерестовые боксы с одним литром воды из системы содержания рыб; перенесите до 10 двойных трансгенных рыб в каждый нерестовый бокс и поместите боксы в темноту для снижения стресса. По истечении минимум шести часов анестезируйте и перенесите обработанных рыб в чашку с покрытием из влажного agarose; с помощью пинцета расправьте хвост. Затем под флуоресцентным микроскопом проведите скрининг рыб на предмет появления Y PET в регенерирующей ткани.

После этого рыб можно использовать для дальнейших манипуляций или вернуть в систему содержания для прекращения индукции респондер-трансгена. После частичной ампутации плавника и обработки докс-индукцией повторно ампутируйте регенерат плавника примерно на уровне четырех-пяти костных сегментов проксимальнее плоскости первоначальной ампутации и в момент времени, зависящий от вашего экспериментального плана, как было описано ранее в этом видео. С помощью пинцета, захватывая только пенек ткани, осторожно разложите регенерат ткани плоско в небольшой чашке Петри, содержащей 4% (масса/объем) PFA в PBS, и фиксируйте в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день дважды промойте регенераты PBS перед их переносом в 0,5 М EDTA-PBS для декальцинации костного матрикса при температуре 4 °C в течение ночи. Затем инкубируйте регенераты в серии растворов сахарозы в PBS при комнатной температуре по 30 минут в каждом, и, наконец, в равных частях 30% сахарозы в PBS и среды для замораживания тканей еще в течение 30 минут.

Перенесите плавники в среду для замораживания тканей и инкубируйте при температуре 4 °C не менее двух часов. Затем поместите криоформы на предметное стекло микроскопа и заполните их средой для замораживания тканей. Перенесите регенераты в криоформы и сориентируйте ткань для получения продольных или поперечных срезов.

Убедитесь, что регенерат расположен прямо, чтобы облегчить секционирование. Вместе с предметным стеклом перенесите криоформы на металлическую стойку, установленную на слой сухого льда, чтобы начать процесс замораживания. После затвердевания среды перенесите криоформы обратно при комнатной температуре, чтобы среда оттаяла на границе раздела с пластиком.

Затем с помощью инструмента, например ручки, вытолкните замороженный блок из криоформы и храните при температуре -80 °C до момента изготовления срезов на криомикротоме. Соберите срезы толщиной от 10 до 14 µm на адгезионных предметных стеклах и храните стекла при температуре -20 °C до использования. Для характеристики экспрессии Tet-респондера в срезах плавника обработайте срезы 100% MEOH, охлажденным до -20 °C, в течение 30 минут.

Осторожно удалите жидкость с помощью бумажного полотенца. Затем дважды промойте срезы в PBT и один раз в PBS по пять минут за каждую процедуру. Инкубируйте срезы в dappy в течение 10 минут, после чего дважды промойте их в PBS по 10 минут за каждую процедуру.

Затем используйте средство для заключения образцов Antifa и покровное стекло для подготовки препаратов перед проведением конфокальной или широкопольной флуоресцентной микроскопии для визуализации образцов после создания функциональной системы TET у zebrafish. Данную систему можно использовать для тестирования функций генов или сигнальных путей в отдельных тканях. Как показано здесь, тетрациклин-активатор под управлением промотора HER 4.3 индуцирует экспрессию TED-респондера только в части тканей регенерата: флуоресценция YFP обнаруживается в пролиферирующей проксимальной бластеме, в то время как в дистальной бластеме и эпидермисе экспрессия отсутствует.

Экспрессия антагониста WNT бета-катенина Axin 1 в домене HER 4.3, содержащем пролиферирующие клетки бластемы, неожиданно не оказывает влияния на пролиферацию регенераторных клеток. Это позволяет предположить, что WNT бета-катенин-сигналинг в пролиферирующей проксимальной бластеме не играет существенной роли в регуляции пролиферации клеток бластемы. Напротив, использование линии с Tet-активатором под управлением убиквитинового промотора для индукции экспрессии Axin 1 во всех тканях регенерата плавника сильно подавляет пролиферацию регенераторных клеток.

Кроме того, экспрессия axon one в домене HER 4.3, который не включает остеобласты, сильно препятствует образованию костной ткани в регенерате. Таким образом, тканеспецифичное воздействие на сигнализацию wind с использованием системы TE on выявляет неожиданные косвенные функции сигнализации wind в регуляции пролиферации клеток и регенерации кости. После освоения эта методика может быть использована для индуцибельной таргетной экспрессии генов в любой интересующей ткани.

Мы успешно применили этот метод для изучения тканеспецифических функций никотиновой сигнализации в регенерирующем хвостовом плавнике рыбки данио. Использование данного метода поможет получить более полное представление о молекулярных детерминантах, регулирующих регенерацию тканей.