Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

Общая цель этой процедуры заключается в создании функциональной системы TED у рыбок данио для достижения условной экспрессии тканеспецифичных генов, как показано на примере регенерирующего хвостового плавника в этом видео. Это достигается путем создания трансгенных линий активатора Tet, экспрессирующих индуцируемый тетрациклином активатор транскрипции, помеченный am cyan в представляющей интерес ткани, и ответных линий Tet, которые содержат интересующий ген ype-метки под контролем чувствительных к Tet элементов. Далее установлены специфические комбинации активатора Тет, ответчика Тет, двойных трансгенных рыб.

Затем экспрессия тканеспецифического трансгена ответчика Tet индуцируется путем введения доксициклина. Наконец, экспрессия трансгена ответчика Tet проверяется путем подготовки здесь участков ткани регенератов плавников. В конечном счете, иммунофлуоресценция используется для визуализации экспрессии трансгена тканевого ответчика Tet.

Основное преимущество этого метода по сравнению с другими методами, такими как индуцированная тепловым шоком экспрессия генов, заключается в том, что система позволяет осуществлять индуцируемую и обратимую экспрессию генов тканеспецифичным образом. Этот метод может помочь получить более глубокое понимание молекулярных сигнальных сетей, управляющих регенерацией рыбьих плавников, поскольку он позволяет анализировать сигнальный путь и функцию генов в отдельных тканях. Хотя мы используем эту технологию для изучения регенерации плавников рыбок данио, она может быть полезной и во многих других контекстах, требующих тканеспецифических манипуляций с функцией генов.

После создания рыбьих линий-ответчиков Tet в соответствии с текстовым протоколом оцените интеграцию зародышевой линии и индуцируемость трансгена путем скрещивания отдельных рыб G zero с ранее созданной линией активатора Tet. Затем соберите эмбрионы и вырастите их до стадии, на которой можно будет оценить индукцию ответчика Tet. Приготовьте 2000 x стоковый раствор доксициклина, используя 50% этанол для растворения доков, чтобы получить концентрацию 50 мг на миллилитр.

Хранить аликвоты доков в защищенном от света месте при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Далее приготовьте Е три эмбриона среды, содержащие доки в конечной концентрации 25 мкг на миллилитр. Затем сцедите большую часть Е из трех сред из зародышей.

Замените его дозами, содержащими Е-3 среды, и верните эмбрионы до 28,5 градусов Цельсия минимум на шесть часов. После инкубации используйте флуоресцентный стереомикроскоп для скрининга эмбрионов на флуоресценцию Y-домашних животных. Установить несколько стабильных трансгенных ответных линий Tet от только что идентифицированных основателей.

Выбирайте линии, которые сильно индуцируют и демонстрируют небольшой мозаицизм в пределах ожидаемой области экспрессии, а также небольшие вариации между отдельными эмбрионами. После того, как были установлены рыбные линии активатора TED и ответчика Tet, сделайте носители активатора Tet с носителями ответчика Tet для генерации двойных трансгенов. Рыбы отбирают эмбрионы, несущие трансген активатора Tet, путем скрининга на голубую флуоресценцию в стереомикроскопе и выращивают голубые положительные эмбрионы до взрослого возраста.

Идентификация взрослых рыб с двойным трансгенным характером, несущих ответчик Tet в дополнение к активатору Tet, с помощью генотипирования на основе ПЦР или по их способности индуцировать экспрессию ответчика Tet в интересующей ткани для проведения анестезии взрослых рыб данио-рерио с помощью хвостового плавника в стакане, наполненном рыбьей водой, содержащей 160 микрограммов на миллилитр трики. Когда рыба перестанет двигаться, с помощью пинцета осторожно перенесите ее на перевернутую чашку Петри и с помощью скальпеля выполните частичную ампутацию хвостового плавника, чтобы лечить с помощью врачей. Подготовьте рассадные боксы с одним литром воды рыбной системы, содержащей 25 микрограмм на миллилитр доксициклина.

В качестве отрицательного контроля добавьте 250 микролитров этанола вместо доксициклина в ящики для разведения с одним литром рыбной системы, перелейте до 10 двойных трансгенных рыб в каждый ящик для разведения и поместите ящики в темноту для снижения стресса. По прошествии минимум шести часов сделайте обезболивание и переложите обработанную рыбу во влажную посуду и с помощью пинцета расправьте хвост. Далее под флуоресцентным микроскопом проводят скрининг рыб на появление Y ПЭТ в регенерирующей ткани.

После этого рыба может быть использована для дальнейшего лечения или возвращена в систему содержания рыб для прекращения индукции ответного трансгена после частичной ампутации плавника, а лечение регенерирует плавник ампутации примерно на четырех-пяти костных сегментах проксимальнее начальной плоскости ампутации и во временной точке, в зависимости от вашей экспериментальной установки, как ранее описано в этом видео с пинцетом, и только с культевой частью ткани. аккуратно положите ткань регенерата в небольшую чашку Петри, содержащую 4% веса на объем PFA в PBS, и зафиксируйте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день. Используйте PBS для промывания регенератов дважды, прежде чем перенести их в 0,5 моляра E-D-T-A-P-B-S для декальцинации костного матрикса при четырех градусах Цельсия на ночь. Затем инкубируйте регенераты в серии сахарозы PBS при комнатной температуре в течение 30 минут каждый и, наконец, равные части 30% сахарозы PBS и тканевой среды для замораживания в течение дополнительных 30 минут.

Переложите плавники в тканевую среду для замораживания и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия не менее двух часов. Затем поместите криоформы на предметное стекло микроскопа и заполните их средой для замораживания тканей. Перенесите регенераты в криоформы и сориентируйте ткань для получения продольных или поперечных сечений.

Убедитесь, что регенерат прямой, чтобы облегчить секционирование. Вместе со предметным стеклом микроскопа перенесите криоформы на металлическую решетку, расположенную на слое сухого льда, чтобы начать процесс замораживания. Когда среда станет твердой, перенесите криоформы обратно к комнатной температуре, чтобы среда оттаяла на границе раздела пластиковой среды.

Затем с помощью такого инструмента, как ручка, вытолкните замороженный блок из криоформы и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до разрезания с помощью криомикротома. Соберите срезы размером от 10 до 14 микрометров на предметных стеклах адгезионного микроскопа и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Чтобы охарактеризовать экспрессию рессора Тета на участках плавников, обработайте срезы 100% MEOH, охлажденным до отрицательных 20 градусов Цельсия, в течение 30 минут.

Аккуратно удалите жидкость с помощью бумажного полотенца. Затем промойте секции дважды PBT и один раз PBS по пять минут каждая. Инкубируйте секции в течение 10 минут в салфетке, прежде чем использовать PBS для стирки дважды по 10 минут каждая.

Затем используйте монтажный агент Antifa и защитный лист для крепления образцов, прежде чем использовать конфокальную или широкопольную флуоресцентную микроскопию для визуализации образцов, установив функциональную TET на системе у рыбок данио. Эта система может быть использована для тестирования функции генов или сигнальных путей в отдельных тканях. Как показано на рисунке, активатор HER 4.3, управляемый промотором, индуцирует экспрессию ответчика TED только в подмножестве тканей регенерированной флуоресценции YFP, которая обнаруживается в пролиферативной проксимальной блосе, в то время как дистальный отдел и эпидермис лишены экспрессии.

Экспрессия антагониста бета-катенина WINT действует в одном из доменов HER 4.3, содержащих пролиферативные клетки blasa, удивительно, не оказывает влияния на регенеративную пролиферацию клеток. Это говорит о том, что ветряной бетаин и передача сигналов в пролиферативной проксимальной бластеме не играют существенной роли в регуляции пролиферации ML-клеток бластов. В противоположность этому, использование активированной линии Tet, управляемой убиквитином, для индуцирования экспрессии аксина 1 во всех тканях регенерата плавников сильно препятствует регенеративной пролиферации клеток.

Кроме того, экспрессия первого аксона в домене HER 4.3, который не включает остеобласты, сильно препятствует формированию костной ткани у регенерата. Таким образом, тканеспецифическая интерференция с сигнализацией ветра с помощью системы TE on выявляет неожиданные косвенные функции сигнализации ветра в регуляции пролиферации клеток и регенерации костей. После освоения эта техника может быть использована для индуцируемой целевой экспрессии генов в любой ткани, представляющей интерес.

Мы успешно применили этот метод для исследования тканеспецифичных функций никотиновой сигнализации ветрового слоя в регенерирующем плавнике S-рыбьего хвоста. Использование этого метода поможет получить более полное представление о молекулярных детерминантах, регулирующих регенерацию тканей.