Применение ДНК-специфичных красителей метиловым зеленым в Флуоресцентная маркировка эмбрионов

В этом видео мы покажем, как очень распространенный гистологический краситель метиловый зеленый может быть использован в качестве чрезвычайно удобной ядерной метки во флуоресцентной микроскопии со специальными приложениями в лазерной конфокальной микроскопии толстых биологических образцов, таких как целые эмбрионы. Вкратце представив метиловый зеленый в качестве ДНК-специфического красителя, опишем способ приготовления исходных и рабочих растворов для флуоресцентного окрашивания. Затем мы покажем экспериментальную процедуру для достижения ядерного окрашивания и подержим несколько эмбрионов рыб, а также примеры полученных конфокальных изображений.

Наконец, будут продемонстрированы и обсуждены отличные физико-химические свойства метиловой зелени. Фредди Миша открыл ДНК в 1869 году и через несколько лет показал, что она образует осадки с относительно новым летописным цветом и окрашивает их в метиловый зеленый цвет. Метиловый зеленый имеет два положительных заряда, которые позволяют ему сильно взаимодействовать с ДНК в ее основной группе, преимущественно связываясь с зонами досягаемости.

Наиболее распространенным применением метилового зеленого является его комбинация в назальном растворе с РНК-красителем перина, метилом, разработанным UNA и Poppen Heim в начале 20-го века. Тем не менее, было проанализировано очень мало флуоресцентных свойств метилового зеленого, и именно поэтому мы решили проверить возможность его использования в качестве очень высокоаффинной и специфической флуоресцентной метки. Для ДНК на клетках.

Метиловый зеленый представляет собой метановый краситель с семью метильными корнями. Эту седьмую группу легко потерять, и она возвращается к кристально-фиолетовому. По этой причине для удаления кристалла требуется количество кристаллического фиолетового, смешанного с метиловым зеленым

Раствор метилового зеленого фиалки можно промыть хлороформом для извлечения кристаллического фиалки. Как мы сразу покажем, для этой цели мы готовим 4%-ный раствор ACU под вытяжным шкафом. Смешиваем его как минимум с двумя частями хлороформа и центрифугой для ускорения разделения фаз.

После центрирования получаем водную фазу с метиловым зеленым и низшую органическую фазу с хлороформом и кристаллическим фиолетовым. Мы восстановили верхнюю фазу и повторяли до тех пор, пока нижняя фаза не стала прозрачной. В конце верхняя фаза восстанавливается и разбавляется.

Такое решение представляет собой стабильную работу на рабочем столе в течение нескольких месяцев. Теперь мы покажем, как ухаживать за целым MO в слое эмбрионов с метамфетаминовым зеленым. Для конфокального микроирования мы будем использовать эмбрион рыбы с высоким содержанием трансплантатов.

В качестве примера возьмите эмбрионы рыбок данио и смойте мусор с помощью ситечка. Инкубируйте их до нужной стадии в воде аквариума или зародышевой среде. Удалите кориум тонким пинцетом, зафиксируйте зародыши в 4% для формальдегида на несколько часов или на ночь.

Затем промойте зародыши в ПБСТ несколько раз. Приготовьте рабочий раствор метиловой зелени, разбавив исходный раствор в ПБСТ в 5-10 000 раз. Инкубируйте эмбрионы в растворе не менее трех часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырехкратном пониженном Цельсии.

В этом примере конфокальные изображения будут получены в меньшем конфокальном микроскопе, оснащенном спектральными детекторами. Максимальное возбуждение достигается с помощью лазера с яркостью 633 нанометра, а детектор настроен на широкий диапазон. В красной области видимого спектра.

Метиловое зеленое излучение позволяет получать качественную ядерную визуализацию даже из глубоких образцов, таких как целые эмбрионы, с минимальными потерями сигнала. В этой первой серии показана сетчатка данио-рерио, ядра которой были окрашены хорошо известным ДНК-окрашиванием в пропорции к трем. Через минуту мы уменьшаем масштаб.

Область сканирования ABL становится очевидной, когда мы проводим тот же эксперимент с метиловым зеленым, видимого обесцвечивания не наблюдается. В следующей серии мы покажем репрезентативные результаты того, что может быть получено с помощью описанного здесь протокола, митотической клетки эпидермиса рыбки данио, в которой можно наблюдать митотические фигуры. Ядро IIC из того же образца, где видна ядерная архитектура.

3D реконструкция части эпидермальной клетки личинки данио-рерио, меченной метилзеленым амалином, более панорамный вид различных форм ядра в течение 48 часов, оплодотворение порта, чешуйница, бр сетчатки. Мы показали здесь простой способ приготовления чрезвычайно недорогого флуоресцентного красителя ДНК, который можно использовать в ядерной метке, хотя мы просто показываем в качестве примера, что их несколько. Эта техника может применяться к вашим эмбрионам или тканям, как цельным, так и секционным.

Он также может быть использован для окрашивания ДНК в гелях и для определения ДНК в растворе с помощью фотометрии.