Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Общая цель следующего эксперимента заключается в синтезе и характеристике наночастиц вакцин на основе липидов, а также в оценке их способности стимулировать экспансию антигенспецифичных цитотоксических Т-лимфоцитов in vivo. Это достигается путем создания имитирующих патогены многослойных везикул с перекрестно-сшитыми межслойными структурами (I CMVs), совместно нагруженных антигеном и адъювантом, для вакцинации наивных мышей. Затем проводится адаптивный перенос антигенспецифичных CD8-положительных Т-клеток, экспрессирующих люциферазу.

На втором этапе экспансия антигенспецифических CD8+ Т-клеток оценивается с помощью прижизненной визуализации всего животного (in vivo). Затем мононуклеарные клетки периферической крови, полученные от иммунизированных ICMV животных, окрашивают флуоресцентно меченными тетрамерами и анализируют методом проточной цитометрии для количественного определения частоты эндогенных антигенспецифических CD8+ Т-клеток в системном компартменте. В конечном итоге биолюминесцентная визуализация может быть использована для отслеживания экспансии антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов в ответ на вакцинацию наночастицами.

Эти методы могут помочь ответить на ключевые предварительные вопросы при разработке вакцин, такие как каков масштаб экспансии цитотоксических Т-лимфоцитов и как эти клетки мигрируют в различные ткани в ответ на вакцинацию наночастицами? Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как анализ Т-клеток in situ после некропсии тканей, является то, что визуализация Т-клеточного ответа in vivo является неинвазивной. Это позволяет проводить лонгитюдный мониторинг одного и того же животного. Начните с перемешивания DOPC и MPB в хлороформе в мольном соотношении один к одному, поддерживая общее количество липидов 1,26 micromoles на партию в стеклянном флаконе объемом 20 milliliter.

Затем добавьте липофильный груз в липидный раствор в желаемой концентрации и продуйте раствор сверхсухим азотом для полного удаления органического растворителя. Оставьте образец в вакууме на ночь. На следующее утро добавьте 200 µL 10 мM BTP, содержащего интересующий вас водорастворимый груз, для гидратации липидной пленки; перемешивайте полученный раствор на вортексе в течение 10 секунд каждые 10 минут на протяжении одного часа при комнатной температуре. Затем перенесите содержимое в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Затем поместите пробирку в ледяную водяную баню и подвергните непрерывному воздействию ультразвука, используя настройку интенсивности 40% на зондовом соникаторе мощностью 125 watt и частотой 20 kilohertz. Через пять минут добавьте в пробирку 4 µL 150 millimolar DTT, перемешайте на вортексе и осадите образец в микроцентрифуге. Затем добавьте в образец 40 µL 200 millimolar хлорида кальция, после чего проведите сшивку липидных слоев, содержащих MPB, с помощью DTT при 37 °C в течение одного часа.

По окончании инкубации центрифугируйте раствор трижды, добавляя по 200 µL дважды дистиллированной воды во время второй и третьей центрифугирований, чтобы удалить из супернатанта остатки хлорида кальция, непрореагировавший DTT и неинкапсулированные материалы груза. После последнего центрифугирования суспендируйте I CMVs в 100 µL свежеприготовленного пегола на 30 минут при 37 °C. Затем промойте везикулы еще два раза дважды дистиллированной водой.

Ресуспендируйте финальный осадок в PBS и храните ICMV при температуре четырех градусов Цельсия. Для характеристики частиц перемешайте охлажденную суспензию ICMV перед разведением небольшой аликвоты образца до общего объема одного миллилитра дважды дистиллированной воды. Затем поместите ICMV в кювету для зета-сайзера и используйте систему измерения динамического рассеяния света и зета-потенциала для определения размера частиц, индекса полидисперсности и зета-потенциала образцов в соответствии с инструкциями производителя.

Для изоляции специфичных к OVA люцифераза-экспрессирующих CD8-положительных Т-клеток сначала выделите селезенки из трансгенных мышей OT-I, экспрессирующих люциферазу. Поместите ткани в 5 мл ледяного PBS с 2% FBS, затем перенесите их в ламинарный шкаф для культивирования тканей.

Используйте поршень от трехмиллилитрового шприца, чтобы перетереть до трех селезенок одновременно через сито с размером пор 70 micron в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Промойте поршень и сито раствором PBS и 2%FBS. Затем доведите общий объем клеточной суспензии до 10 миллилитров на одну селезенку.

Определите общее количество клеток, затем центрифугируйте их для осаждения. Далее, используя имеющийся в продаже набор для магнитной негативной селекции, выделите CD8-положительные клетки селезенки в соответствии с инструкциями производителя. Затем промойте Т-клетки в PBS.

Подсчитайте клетки и инкубируйте от 2 до 3 × 10⁵ клеток в 20 µL блокирующего антитела к CD 1632 мыши. Через 10 минут добавьте к клеткам 20 µL антител anti-CD8 APC на 30 минут и оцените чистоту популяции CD8-положительных T-клеток, выделенных с помощью магнитных бусин, методом проточной цитометрии. Затем путем внутривенных инъекций в хвостовую вену в 200 µL PBS проведите адаптивный перенос от 1 до 10 × 10⁵ OT-1 люциферазных CD8-положительных T-клеток наивным выбритым альбиносным мышам линии C57BL/6. Через 24 часа введите вакцину в соответствующие дни после вакцинации.

Через 10 минут введите животным Lucifer в дозе 150 мг/кг; затем в течение 5–10 минут регистрируйте сигнал биолюминесценции с помощью системы визуализации целого организма для визуализации OT-1 Lucifer CD8+ T-клеток с целью определения количества антигенспецифических CD8+ T-клеток в соответствующее время. После вакцинации соберите примерно 100 µL крови у вакцинированных мышей методом подчелюстного кровопускания в пробирку с покрытием из EDTA калия, несколько раз переверните пробирку, чтобы предотвратить свертывание. Затем перенесите 100 µL крови в микроцентрифужную пробирку и добавьте 1 мл буфера для лизиса клеток.

Через две-три минуты центрифугируйте клетки и удалите супернатант. Промойте оставшиеся PBMC в 1 мл буфера FACS и заблокируйте неспецифическое связывание с помощью CD 163, как было продемонстрировано ранее. Через 10 минут разделите клеточную суспензию по пробиркам для FACS с круглым дном объемом 4 мл и добавьте в каждый образец 20 µL раствора H2-Kb тетрамера, конъюгированного с PE, согласно спецификациям производителя.

После 30 минут выдержки на льду добавьте 20 µL соответствующего коктейля антител в каждый экспериментальный образец и единичные контрольные антитела fluoro four для каждого тетрамера или антитела с меткой fluoro four в каждый контрольный образец. Наконец, после еще одной 20-минутной инкубации промойте все образцы в буфере fax, ресуспендируйте осадки в буфере fax с добавлением DPI и проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии. CMVs, совместно нагруженные с белковыми антигенами fluoro four tact и флуоресцентными липофильными красителями, позволяют визуализировать доставку антигена и наночастиц in vivo. Например, данные конфокальной микроскопии показывают, что растворимый антиген, введенный подкожно в основание хвоста, достигает дренирующих лимфатических узлов в течение четырех часов после введения и выводится к 24 часам.

Напротив, перегруженные I CMV сначала обнаруживаются на периферии дренирующих лимфатических узлов через 24 часа после введения, при этом продолжается их накопление, что приводит к образованию крупного депозита ova I CMV в ткани дренирующего лимфоузла. К четвертому дню биолюминесцентная визуализация мышей C 57 BL six, которым в день вакцинации были адаптивно перенесены OT one Luciferase CD eight положительные T-клетки, демонстрирует минимальный фоновый уровень OT one luciferase tcell к четвертому дню после вакцинации. Однако у мышей, иммунизированных ova MPI CMVs, наблюдается выраженный биолюминесцентный сигнал в дренирующих паховых лимфатических узлах.

С другой стороны, у мышей, вакцинированных растворимым OVA, наблюдается гораздо менее выраженная экспансия OT-I Lucifer CD8-положительных Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах. Кроме того, у мышей, иммунизированных растворимым OVA и MPLA без какой-либо адаптивной передачи антигенспецифических Т-клеток, не отмечается значимой экспансии OVA-специфических CD8-положительных Т-клеток, что подтверждается еженедельным мониторингом PBMC. В то же время вакцинация ICMV вызывает значительно более сильный эндогенный ответ CD8-положительных Т-клеток, достигающий пика в 28% syn fecal-тетрамер-положительных Т-клеток в пуле CD8-положительных Т-клеток среди PBMC к 41-му дню. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как синтезировать наночастицы на основе липидов, проводить иммунизацию, а также визуализировать и количественно определять экспансию CTL in vivo.

Эти методы могут быть дополнительно модифицированы для получения более детальной информации о CTL-ответе. Например, анализ окрашивания может быть дополнен использованием дополнительных маркеров, таких как CD 1 27, BCL two и K lrg one, для оценки фенотипа памяти клеток.