Оптимизированная Техника по обогащению для изоляции Arthrobacter Бактериофаг Виды из образца почвы изолирует

Общая цель этой процедуры заключается в выделении фаз бактерий arthrobacter из образцов почвы с использованием протокола обогащения. Это достигается путем предварительного сбора образцов почвы и выделения жизнеспособных фаговых частиц из загрязняющих почву микроорганизмов. Вторым шагом является заражение бактериальных клеток хозяина arthrobacter выделенными фаговыми частицами.

Затем инфицированные бактериальные клетки наносятся на шнековые пластины для идентификации фага, о чем свидетельствует образование бляшек. Заключительным этапом является очищение нужных фагов от четко изолированных бляшек методом полосовой пластины. В конечном счете, этот метод обогащения оптимизирован для относительно простого выделения фагов arthrobacter из видов arthrobacter KY 3 9 0 1.

Основным преимуществом этого метода перед существующими методами обогащения является добавление тонко отфильтрованного образца почвы к чистой культуре бактерий-хозяев во избежание роста конкурирующих бактерий. Хотя этот метод доказал свою эффективность для выделения фагов arthrobacter, он должен быть применим для выделения фагов от других бактерий-хозяев. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы узнали, что другие исследователи испытывают трудности с поиском фагов arthrobacter

С помощью традиционных методик обогащения. Мои студенты продемонстрируют методы, используемые для успешного выделения фагов arthrobacter. Клетки Arthrobacter культивируют из колоний, нанесенных на шнековую пластину LB, инкубируют при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух-трех дней.

Используйте стерильную петлю, чтобы выбрать колонию и добавьте ее в 50 миллилитров фунта бульона. В непонятной культуре колбу инкубируют в трясущемся инкубаторе со скоростью 225 об/мин при 30 градусах Цельсия в течение примерно 24 часов. Для получения экспоненциальных или ранних стационарных фаз клеток для экспериментов по фаговой инфекции.

Внимательно следите за состоянием роста бактерий, чтобы предотвратить попадание клеток в средний и поздний неподвижный рост. Государство. Идеальный наружный диаметр 600 для изоляции фагов составляет от 0,5 до 0,7. Поскольку бактерии рода arthrobacter являются обычными почвенными бактериями, их и заражающие их фаги можно найти в большинстве типов почв.

Соберите от 200 до 400 грамм почвы с нужного места. Добавьте не менее 400 миллилитров фагового буфера в почву в достаточно больших стаканах, чтобы не менее 200 миллилитров фагового буфера находилось в надосадочной жидкости и могло быть извлечено путем осторожного перемешивания или взбивания до тех пор, пока почва не станет взвешенной, и дайте осадку почвы осесть, как правило, в течение 30 минут. Затем удалите остатки почвенного осадка, пропустив экстракт почвы через фильтровальную бумагу методом вакуумной фильтрации.

Добавьте четыре грамма порошка LB к 200 миллилитрам отфильтрованного почвенного экстракта и перемешайте, чтобы получился 2% раствор. Пропустите раствор через фильтр 0,22 микрона методом вакуумной фильтрации для получения стерильного фильтрата. Если возможно, немедленно переходите к следующему шагу.

Тем не менее, при необходимости, отфильтрованные образцы могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до недели, прежде чем продолжить. Вместе с тем, количество жизнеспособных фаговых частиц будет уменьшено с помощью септических методов аликвота кратных 50 миллилитров фильтрующей стерилизованной смеси почвенного экстракта LB до отдельных 250 миллилитров. В стерилизованные встряхивающие, сбитые с толку колбы с культурой добавляют стерильный 2,0 молярный раствор хлорида кальция до конечных нужных концентраций.

Поскольку различные фаги arthrobacter оптимально растут в различных условиях хлорида кальция, начните эту процедуру с добавления от одного до 2,5 миллилитров культуры бактерий поздней экспоненциальной или ранней стационарной фазы в каждую из колб, содержащих стерилизованную фильтром смесь почвенного экстракта LB. Если ОД 600 культуры составляет от 0,5 до 0,7, используйте один миллилитр. Если наружный диаметр 600 выше 0,7, используйте 2,5 миллилитров.

Встряхивайте колбы со скоростью 250 об/мин при температуре 30 градусов Цельсия в течение примерно 24 часов в встряхивающем инкубаторе. По истечении 24-часового инкубационного периода извлеките обогатительные колбы из встряхивающего инкубатора. Разбавьте образцы обогащения в десять раз в фаговом буфере.

Установите пробирки с культурой по 0,5 миллилитра позднего экспоненциального или раннестационарного. Фаза культивирования бактерий. Добавьте в пробирки с культурой различное количество от пяти микролитров до 500 микролитров разведенной обогащенной культуры.

Добавьте хлорид кальция в пробирки для культивирования, чтобы получить конечную концентрацию в пять миллилитров, равную концентрации, присутствующей в исходной обогащающей колбе. Используйте диапазон различных концентраций хлорида кальция для выбора многих фагов с различными зависимостями хлорида кальция. Добавьте 4,5 миллилитра верхнего шнека LB в каждую пробирку для культивирования и вылейте смесь на пластину шнека LB.

Аккуратно перемешайте, чтобы равномерно распределить по пластине, и дайте верхнему шнеку застыть в течение примерно 15 минут. Переверните пластины и инкубируйте при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи до 48 часов. Варьируйте время инкубации для оптимизации фагов, присутствующих после 24-часовой инкубации, проверьте образование бляшек на планшетах.

Большинство выделенных фагов получают из планшетов, инкубированных при температуре 30 градусов Цельсия при концентрации хлорида кальция от одного до 2,5 миллимоляров после 24-часового инкубационного периода. Требуются технические знания, чтобы аккуратно распределить пластины по пластине шнека для создания равномерной полосовой пластины. Простерилизуйте деревянную палочку, пропустив ее через пламя и дав ей остыть.

Кратковременно коснитесь таблички стерильной деревянной палочкой и осторожно потрите палочку о пластину шнека, как показано на рисунке. Повторяйте это с помощью чистой палочки для каждого прохода. После того, как пластина шнека LB будет протерта не менее трех раз, отметьте область с наименьшей концентрацией предполагаемых фаговых частиц.

Аккуратно нанесите 0,5 миллилитров артробактерия и 4,5 миллилитра расплавленного верхнего шнека LB на отмеченный участок и дайте ему равномерно распределиться по пластине. Дайте верхнему шнеку застыть не менее часа, когда пластина затвердеет, переверните и инкубируйте ее в течение ночи. Повторяйте технику полосовой бляшки в течение как минимум трех итераций, чтобы убедиться, что чистый фаг изолирован.

Планшеты могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до недели по мере необходимости между прожилками без существенной потери жизнеспособности фагов. После того, как желаемые бляшки выращены и выделены на последней полосовой пластине, коснитесь одной хорошо изолированной бляшки наконечником микропипетки и повторно суспендируйте в 100 микролитрах фагового буфера. Последовательно разбавьте этот раствор до 10 до минус восьмого разведения, пропустив 20 микролитров образца в 180 микролитров свежего фагового буфера. Добавьте по 10 микролитров каждого разведения к 0,5 миллилитрам выращенного артробактерия в культуральную пробирку на пять-10 минут при комнатной температуре.

Затем смешайте зараженные бактерии с 4,5 миллилитрами расплавленного верхнего шнека, содержащего ту же концентрацию хлорида кальция, которая использовалась для выделения фага из исходного образца почвы. Инкубируйте пластины на ночь. Все разбавления, сделанные при четырех градусах Цельсия, приберегите до следующего дня.

Определите фаговое разведение злаковых культур, необходимое для создания паутинного узора, с помощью традиционного анализа титра бляшек. Определите, что пластина с рисунком паутины в основном лишена бактерий, но содержит остатки бактерий, которые еще не были пронизаны фагами. Добавьте пять миллилитров поздней экспоненциальной или ранней стационарной культуры артробактерия в стерильную колбу для культур объемом 50 миллилитров.

Добавьте 100 микролитров разбавления, которое придало культуре arthrobacter узор паутины, и позвольте фагам заразить клетки бактерии в течение 5-10 минут. При комнатной температуре добавьте в колбу расплавленный верхний шнек lb, содержащий ту же концентрацию хлорида кальция, которая использовалась для первоначальной идентификации фаговой пластины. По пять миллилитров этой смеси на каждую из 10 свежих тарелок LB.

Дав верхнему шнеку затвердеть, перевернуть и инкубировать пластины при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи на следующий день, наполните пластины с сетчатым рисунком пятью миллилитрами фагового буфера на пластину и храните в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Отфильтруйте лизат фага через шприцевой фильтр 0,22 мкм. Храните этот окончательный фаговый запас при температуре четыре градуса Цельсия для длительного хранения.

Добавьте равное количество лизата фага к стерильному глицерину в небольших флаконах для архивирования запасов при температуре минус 80 градусов Цельсия в процедуре обогащения, продемонстрированной в этом видео, показанном в этом видео методе полос бляшек для выделения чистых популяций фагов после первоначального обогащения и осаждения на LB-оже, являются репрезентативными результатами выделения бляшек для фага DI при комнатной температуре. 30 градусов по Цельсию и 37 градусов по Цельсию. Красные круги на двух пластинах окружают четко изолированные бляшки. Фаг Дилана производит аналогичные бляшки при трех разных температурах.

В качестве альтернативы, для выделения чистого фагового изолята можно использовать традиционный стандартный анализ титра бляшек. Этот анализ был использован здесь для эмпирического определения числа титров фагов и количества звеньев, образующих бляшки, для формирования узора перепонки на пластине. Набор серийного разведения для фага банана показан с примером того, как должен выглядеть хороший узор паутины.

Это электронно-микрографические изображения 20 фагов arthrobacter, выделенных методом обогащения. Из 25 выделенных в настоящее время фагов 23 являются цифовирусами с довольно длинными хвостами. Два из выделенных фагов являются миовирусами, головки которых диаметр по длине аналогичен диаметру хвоста.

После освоения обогащающее покрытие должно позволить успешно выделять фаги arthrobacter из различных образцов почвы. Посмотрев это видео, у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить фаг используемым в полосе методом краски из окружающей среды образца почвы.