Гепатоцитов конкретных абляция в данио рерио по изучению желчных приводом печени Регенерация

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы индуцировать абляцию гепатоцитов у рыбок данио для анализа билиарной регенерации печени. Это достигается путем предварительного воздействия на трансгенных личинок, экспрессирующих нитроредуктазу в своих гепатоцитах, на Metrona или MTZ. На втором этапе оценивается уровень абляции гепатоцитов на основе относительного размера печени.

После обработки МТЗ на заключительном этапе собираются абляционные личинки буллинга с крошечной печенью, в конечном итоге размер печени и экспрессия маркеров печени в регенерирующей печени измеряются с помощью эпифлуоресценции и конфокальной микроскопии соответственно. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как модели активации овальных клеток грызунов, заключается в том, что с помощью этого метода регенеративные гепатоциты в основном получают из клеток желчного эпителия. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенерации печени, такие как как билиарные или прогенаторные клетки печени способствуют регенерации печени.

Для проведения рассчитанных по времени спариваний подсаживают взрослых самцов и самок полузиготных или гомозиготных рыб на ночь с разделителем между ними. Снимите разделитель на следующее утро, когда требуется спаривание, используя мелкое пластиковое сетчатое ситечко для сбора эмбрионов, переверните сетчатое фильтр вверх дном и используйте сжимающую бутылку, чтобы промыть поверхность сетки тонкой струей яичной воды. Затем перенесите до 100 эмбрионов в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 25 миллилитров яичной воды, и поместите чашку при температуре 28 градусов Цельсия, чтобы подавить пигментацию.

Добавляйте ПТУ в культуру до 10 часов. После внесения удобрений через 80 часов. После персонализации обезболите личинок трикой и используйте эпифлуоресцентный микроскоп для сбора положительных личинок CFP, оставляя только животных с печенью аналогичного размера.

Затем замените воду для яиц Trica свежей яичной водой, дополненной PTU, и верните личинок рыбок данио-рерио с положительным результатом CFP в инкубатор при температуре 28 градусов Цельсия. Чтобы обработать личинок данио-рерио МТЗ, сначала разделите соответствующее количество личинок на два разных сосуда для культивирования. Подопытную группу личинок держать в растворе свежеприготовленного МТЗ, а контрольную группу – в яичной воде.

Дополнен ДМСО. Накройте опытную группу алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоинактивацию МТЗ, и инкубируйте обе группы личинок данио рерио при температуре 28 градусов Цельсия в конце периода абляции. Удалите раствор МТЗ с пластин и промывайте обработанные личинки МТЗ два-три раза 25 миллилитрами яичной воды и закручивая, сбрасывая яичную воду после каждой промывки.

После последнего промывки иммобилизуйте личинки с половинной концентрацией трики, ранее использованной для избежания отека сердца и гибели личинок, обработанных МТЗ. Затем используйте фильтр CFP на эпифлуоресцентном микроскопе для оценки уровня абляции гепатоцитов на основе относительного размера печени личинок, обработанных МТЗ. Рассмотрим рыбу данио с крупной печенью, составляющую от 0 до 5% личинок, которые не должны быть абляционированы.

Печень среднего размера составляет от 10 до 20% личинок, подлежащих частичной абляции, и печень с очень мелкой печенью, представляющая от 80 до 90% личинок, подлежащих полному абляции. После классификации всех животных обнаружите личинок с неабляционной или частично абляционированной печенью, оставив только рыб данио с крошечной печенью, указывающей на сильную абляцию гепатоцитов для анализа печени. В момент нулевого часа регенерации перенесите личинок в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров

Сразу после промывки МТЗ и источника CFP замените яичную воду на буфер MPEM с 3% формальдегидом для фиксации на роторе в четыре градуса Цельсия на ночь. На следующее утро замените раствор для фиксации одним миллилитром P-B-S-D-T и поворачивайте личинки еще пять минут. Затем все неподвижные личинки помещают в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую свежие P-B-S-D-T под микроскопом для препарирования, и с помощью щипцов вручную удаляют желток и грудные плавники, когда все личинки будут обрезаны.

Пересадите до 20 животных в трубку объемом 1,5 миллилитра и замените P-B-S-D-T одним миллилитром блокирующего раствора. Через два часа на ротаторе при комнатной температуре замените блокирующий раствор на 100 микролитров первичного коктейля антител для ночной инкубации при четырех градусах Цельсия. При укачивании на следующий день удалите первичный раствор антител и промойте рыбок данио P-B-S-D-T в течение пяти 10-минутных полосаний.

После последнего промывания добавьте 100 микролитров вторичного антитела для двухчасовой инкубации при комнатной температуре с покачиванием. Наконец, промойте личинок пять раз в P-B-S-D-T, как только что показано. Сориентируйте личинки сбоку на предметном стекле микроскопа и добавьте каплю монтажного материала.

Затем тщательно накройте каждую рыбку данио покровным стеклом и заклейте покровное стекло лаком для ногтей. Лечение МТЗ в течение 36 часов от 3,5 до пяти дней после оплодотворения резко уменьшает размер печени. После вымывания МТЗ сильная экспрессия CFP и красного цвета вновь появляются в течение 30 часов, что оценивается по экспрессии LCAM в мембране клеток желчного эпителия.

Внутрипеченочная желчевыводящая сеть первоначально разрушается, но затем восстанавливается через 54 часа после промывания, что указывает на быструю регенерацию и восстановление печени. На этих изображениях показано, что регенерирующие гепатоциты, трансгенные для ядерного красного флуоресцентного белка, экспрессируются исключительно в желчных эпителиальных клетках печени, большинство из этих H, двух БМ, вишневых положительных клеток в регенерирующей печени, экспрессируют HNF четыре альфа в час регенерации нулевой в час регенерации четыре C восемь. Гепатоциты, получавшие лечение МТЗ, CFP-положительные, все еще сохраняют экспрессию вишни H two BM, что указывает на превращение клеток билиарного эпителия в гепатоциты при значительной потере гепатоцитов.

Приступая к этой процедуре, важно помнить о выборе полностью абляционного после лечения МТТ для последующей регенерации печени на лизисе Действие после ее развития. Этот метод проложил путь исследователям в области регенерации печени к изучению механизмов, лежащих в основе предшественника печени, клеточной регенерации печени. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как использовать эту географическую модель работы цитов для исследований билио-обусловленной дегенерации печени.