ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Мы хотели бы поблагодарить Алекса Миллера за редактирование рукописи. Эта работа была поддержана исследовательскими грантами, предоставленными M.G. от Cure CMD, Struggle Against Muscle Dystrophy (SAM) и Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Ткань Урожай и замораживание мышечных тканей <ol><li> Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан). Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и использовать дополнительный метод сдерживания, такие как эксикаторе или колпаком, содержащей ватным тампоном, смоченным в ИФ. </li><li> Подтвердите смерть, крепко сжимая в подушечку лапы. Используйте дополнительный метод эвтаназии, таких как рак шейки матки дислокации. </li><li> Намочите шерсть с 70% -ным спиртом, чтобы уменьшить прилипание сыпучих пряди волос на мышцы. Очистите кожу с помощью лимба тонких щипцов, таких как # 5. </li><li> Осторожно отделите мышцу интерес (передней большеберцовой (TA) в данном случае) из костей внизу, начиная с сухожилия и удалить. </li><li> Акцизный мышцы, закройте его в ОСТ (Оптимальная температура для резки соединение), и положите его плашмя на меченым одноразовой формы замерзания. Убедитесь, что мышцы на его нормальное физиологическое положение (головой к тайл), не растягивая. Кроме того, заморозить мышцы на маленьких площадях пенополистирола и закрепить его с помощью насекомых булавками, чтобы обеспечить правильную длину мышц. </li><li> Холод 2-метилбутан (изопентана) в стальной стакан с использованием жидкого азота. Это займет в среднем 3 - 5 мин. Продолжайте перемешивание с перерывами до белого осадка не начнут образовываться на дне и стенках стакана. Примечание: Когда это происходит, изопентан достигла оптимальной температуры замерзания (-150 ° С) </li><li> Опустите форм, содержащих мышцы в охлажденной 2-метилбутана. Замораживание мелкие мышцы, такие как диафрагма и разгибатель большого пальца (EDL) для 6 - 12 сек и более крупных мышц, как икроножной камбаловидной (GS) и трицепс для 15 - 20 сек. Не замораживать мышцы слишком долго, так как это может привести к растрескиванию. </li><li> Передача замороженных тканей на сухом льду и пусть изопентан испаряются (обратите внимание, что этот процесс занимает в среднем около 15 - 20 мин). Оберните тканей в алюминиевую фольгу и хранить их в ULTRA низкая температура (-70 ° С до -80 ° С) до секционирования. </li></ol> 2. Внедрение тканей в октябре подготовить тканей блок <ol><li> Транспорт ткани на сухом льду, чтобы предотвратить cyrostat оттаивания. Передача ткани в криостате камеры (набор от -20 до -24 ° С, чтобы избежать полного оттаивания тканей), и пусть они уравновешивают в течение 30 мин. </li><li> Поверните отсек Пельтье охлаждения на. Если криостат не имеет этой охлаждение, используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить октября Не позволяйте мышц оттепель в любой момент в течение вложения, так как это может привести к повреждению замораживания. </li><li> Добавить равномерное тонкий слой ОКТ на диске образца и дайте ему остыть. Когда большинство из центра развертывания заморожен на дно, а еще жидкость сверху, вставьте ткань на правильной ориентации (перпендикулярно по октябрь для поперечных сечений и параллельно по октябрь для продольных секций). Используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить Office. Нажмите unembeded часть ткани с тепловым добractor и ждать в течение 45 сек. </li><li> Добавить еще один тонкий слой ОКТ вокруг мышц, спрей с распылителем охлаждения аэрозоля и извлекать тепло, как в предыдущем шаге. </li><li> Продолжайте добавлять октября небольшими порциями и быстро заморозить центра развертывания с использованием комбинации аэрозоля охлаждения спрей и тепла экстрактор, пока вся мышца покрыта. </li><li> Положить тепла экстрактор на верхней части блока тканей и ждать в течение 5 мин. </li></ol> 3. Подготовка секций и Выявление Разделы с середины живота области мышц <ol><li> Установите образец на образец голове. Затянуть ручку, чтобы закрепить диск. Убедитесь, что образец диск находится в хорошем контакте с образцом руководителя. </li><li> Отрегулируйте температуру в камере до -21 и между -24 ° C и подождите, пока заданная температура не будет достигнута. </li><li> Настройте параметры толщины (7 мкм); отделка блок по продвижению или втягивания блока с помощью грубой и тонкой настройки. </li><li> Соберите разделына предварительно нагревают положительно заряженные предметные стекла, нажав на верхнюю часть слайда на участках, используя притяжение между противоположными зарядами, чтобы облегчить адгезию отрезанных секций с ползуном. </li><li> Определение секции середине живота путем измерения площади поперечного сечения (CSA) секций. Делайте это, используя программное обеспечение обработки изображений на компьютере, подключенном к микроскопу. ПРИМЕЧАНИЕ: фазового контраста изображения взяты и окружность всей мышцы измеряется с помощью функции отслеживания на программе. Это даст как CSA, а также минимальный диаметр хорька (меру волокна размером поперечного сечения, что выражается в виде наименьшего расстояния между двумя параллельными касательными на противоположных сторонах частицы) измерений. Примечание: При CSA и минимальный диаметр хорек измерения начинают плато, в середине живота была достигнута. </li><li> Инвентаризация и архив слайды при температуре -80 ° C для дальнейшего окрашивания. Примечание: Окт не должны быть удалены до staininг процедуры. После того, как слайды coverslipped, они готовы быть окрашены немедленно. </li></ol> 4. Окрашивание ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как подробные шаг за шагом процедуры могут быть найдены на спецификации и должны следовать за процедурами окрашивания, личный оптимизация может потребоваться для получения оптимального окрашивания. <ol><li> Из-за монтажа информации (смотри таблицу) не смешивается с водой, обезвоживают слайды посредством увеличения сортов спирта (2 мин каждый в 70%, 95% и 100% этанола) и очистить их с ксилолом (100% в течение 5 мин), чтобы обеспечить слайды не становятся непрозрачными в течение долгого времени. </li><li> Покровное разделы и дайте им высохнуть. Изображение с микроскопа оснащены ПО для обработки изображений. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
<li>Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+apoptosis+improves+outcome+in+a+model+of+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy.</a> The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).</li>
<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Авторам нечего раскрывать.

Гистологии и иммуногистохимии были использованы в качестве основных инструментов в понимании проявление и прогрессирование патологии в различных нервно-мышечных нарушений. Классически, мышечные биопсии были впервые зафиксированы в формальдегид, а затем с встроенной парафина. В то время как формальдегид фиксация сохраняет архитектуру ткани и позволяет хранить тканей и транспорта при комнатной температуре, он также инактивирует ферменты и белки, требующими сшивок дальнейшие шаги для достижения точной иммуноокрашивания. Эт...

Экспертиза мышечной гистологии играет важную роль в понимании различных типов нервно-мышечных расстройств 1-4. В сочетании с другими методами, что позволяет исследователям получить лучшее представление о проявлении и прогрессирования патологии, а также может иметь важное значение для оценки эффективности терапевтического вмешательства 5-10. Однако, чтобы быть точным, ткани должны быть сохранены в надлежащем порядке, с тем чтобы сохранить физиологическое состояние непосредственно перед удалением. Это требует большой осторожности во время удаления, сохранения, секционирования и окрашивания. Ткани могут быть получены двумя различными способами для легкой микроскопическом исследовании. Первый способ, фиксированных формалином парафин (FFPE) секции, требуется ткани, чтобы быть фиксировали в 10% буферном растворе формальдегида природного прежде чем с встроенной парафина 11,12. Шаг фиксация помогает сохранить морфологию лучше, но также перекрестные ссылки эндогенного прoteins что требует сложная антиген извлечения процедуры иммунным и исключая возможность окрашивания ферментативной на таких участках 12. Замороженные срезы, с другой стороны, не должны быть предварительно обработаны или фиксированной; Поэтому, белки способны удерживать родные биологические конформации 13,14. Кроме того, замороженные срезы также позволяют быстро времени оборота, что в некоторых случаях необходимо, например, в интраоперационной диагностике сарком и других хирургических биопсий 15. Тем не менее, если не сделано должным образом, этот метод склонен к заморозить ущерб, который вносит изменения в мышечной архитектуре, делая секции непригодным для гистологического исследования. Эта статья будет выделить наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для того, чтобы достичь оптимального окрашивания для тщательного осмотра.

<table><tbody><tr><td>Криостат</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 США, рабочий телефон 1-800-248-0123 Альтернатива: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Микроскоп</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Мелвилл, Нью-Йорк 11747-3064 США, Тел.: 1-631-547-8500 Альтернатива: Olympus</td></tr><tr><td>Программное обеспечение для анализа изображений</td><td>Nikon Программное обеспечение для обработки изображений, Basic Research</td><td>, Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Мелвилл, Нью-Йорк 11747-3064, США, Тел.: 1-631-547-8500 Альтернативы: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Изофлуран</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Феникс, AZ 85029 США</td></tr><tr><td>ОКТЯБРЬ</td><td>4583</td><td>Сакура Инк.</td><td>Торренс, Калифорния 90501 США Альтернативный источник: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс, 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Одноразовая тканевая форма</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost плюс слайды</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Этиловый спирт</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-метилбутан</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, Сент-Луис, MO 63103 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, MA 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Кембридж, Массачусетс 02139 США Альтернативный источник: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

И что нельзя делать в подготовке мышц криосрезы для гистологического анализа

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Гистологическая оценка мышечных биопсий служил в качестве незаменимого инструмента в понимании развития и прогрессирования патологии нервно-мышечных расстройств. Тем не менее, для того, чтобы сделать это, правильный уход должны быть приняты, когда иссечение и сохранение тканей для достижения оптимального окрашивания. Один из способов сохранения тканей включает фиксации тканей в формальдегид, а затем встраивания их парафином. Этот метод сохраняет морфологию также и позволяет длительное хранение при комнатной температуре, но громоздка и требует обработки токсичными химикатами. Кроме того, результаты формальдегида фиксации в антигена сшивки, что требует протоколы антиген извлечения для эффективного иммунного окрашивания. Напротив, замороженные секционирование не требует фиксации и, таким образом, сохраняет биологическую конформацию антигена. Этот метод также обеспечивает явное преимущество в быстрой свою очередь вокруг времени, что делает его особенно полезным в ситуациях, требующих быстрого гистологическая оценка как intraoperaного хирургических биопсий. Здесь мы опишем наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для визуализации с различными гистологическими и иммунологическими пятен.

Установка для сбора и замораживания тканей можно увидеть на рисунке 1. Вырезанные ткани должны храниться на марлю, пропитанную PBS, чтобы избежать высыхания (рис 1А). Когда ткани выбирают так, чтобы быть использованы для гистологического анализа они должны быть погружены в ОСТ и раскладывают на крио плесени в правильной ориентации, и как можно ближе к физиологическому длины, насколько это возможно, чтобы обеспечить точную морфологию (Фигура 1В). Шлам изопентана, подходя...

Здесь мы демонстрируем наиболее эффективные методы замораживания, встраивания, криосекции и окрашивания биопсий мышц, чтобы избежать замораживания артефактов.

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Общая цель данной процедуры заключается в том, чтобы избежать ошибок при подготовке замороженных срезов биоптатов мышц, таких как возникновение артефактов замораживания. Это достигается путем быстрого предварительного замораживания мышцы в 2-метилбутане, охлажденном жидким азотом. После уравновешивания биоптатов мышц в криостате их заливают средой для оптимальной температуры резания (OCT) при комнатной температуре небольшими порциями с быстрым замораживанием с помощью аэрозольного охлаждения и отвода тепла.Затем делают срезы толщиной семь микрон и переносят их на теплые положительно заряженные предметные стекла. Заключительным этапом является окрашивание срезов ткани в соответствии с необходимостью для оценки гистологии ткани. В конечном итоге правильно подготовленные биоптаты мышц позволяют получить хорошо сохранившуюся гистологическую структуру ткани без артефактов замораживания.Таким образом, основным преимуществом данного метода по сравнению с другими существующими способами, такими как серийное срезание тканей, фиксированных в парафине, является высокая скорость выполнения и отсутствие изменений в структуре или функции эндогенных антигенов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы, касающиеся биологии мышц в норме и при патологии, такие как рост, регенерация, воспаление, фиброз и некроз. Применение данной техники распространяется на терапию или диагностику мышечных заболеваний, так как она позволяет определить состояние здоровой и пораженной мышцы.Хотя данный метод позволяет получить сведения о различных формах мышечной дистрофии, его также можно применять к другим состояниям, таким как кахексия, связанная с терминальными стадиями рака и СПИДа, а также потеря мышечной массы у пожилых людей. Начните с эвтаназии мыши с помощью передозировки isof fluorine под вытяжным шкафом и с использованием вторичного уровня изоляции, например, колокола.Теперь смочите шерсть 70% alcohol. Это предотвратит прилипание отдельных волосков к мышцам. Далее снимите кожу с конечности, используя тонкий пинцет номер пять.Осторожно отделите исследуемую мышцу от кости, начиная от сухожилия. В данном случае изолируется m. tibialis anterior. После иссечения мышцу поместите в среду OCT и разложите ее ровным слоем в маркированную одноразовую форму для замораживания.Перед нарезкой позже будет добавлено больше OCT. Убедитесь, что мышца находится в нормальном физиологическом положении вдоль оси «голова-хвост» и не растянута. Теперь охладите.Поместите некоторое количество изопентана в стальной стакан, используя жидкий азот. Время от времени перемешивайте его пластиковым шпателем в течение трех-пяти минут. Когда образуется белый осадок, изопентан достигнет оптимальной температуры; в этот момент погрузите заполненные формы в раствор.Замораживание небольших мышц, таких как диафрагма и длинный разгибатель пальцев, занимает от 6 до 12 секунд. Для более крупных мышц требуется от 15 до 20 секунд, так как чрезмерное охлаждение может привести к образованию трещин. Следующим шагом является помещение замороженных тканей на сухой лед для испарения остатков изопентана, что занимает около 15–20 минут.После высыхания ткани оберните их в фольгу и храните в морозильнике при температуре -80 °C до момента изготовления срезов. Перед началом секционирования перенесите замороженные ткани в криостат на сухом льду.Перенесите ткань в камеру криостата, установленную на температуру от -24 до -20 °C, и оставьте для equilibration в течение 30 минут. При такой температуре ткани полностью не разморозятся. Затем приступайте к заливке ткани.При наличии возможности включите охлаждение в отсеке Пельтье. Затем нанесите равномерный тонкий слой OCT на диск для образцов и дайте ему охладиться. В-третьих, когда OCT замерзнет у основания, но все еще будет оставаться жидким сверху, поместите ткань, ориентируя ее перпендикулярно слою OCT для получения поперечных срезов или параллельно слою OCT для получения продольных срезов.Теперь используйте аэрозольный охлаждающий спрей для быстрого замораживания OCT. Затем приложите экстрактор тепла к незамороженной части ткани и удерживайте его в течение 45 секунд. Не допускайте размораживания мышцы на любом из этапов этого процесса.Если криостат не оснащен охлаждением ячейки на элементах Пельтье, используйте аэрозольное охлаждение для быстрого замораживания OCT вокруг ткани. Теперь нанесите еще один тонкий слой OCT вокруг мышцы, обработайте его аэрозольным охладителем и удалите тепло, как на предыдущем этапе. Продолжайте добавлять OCT небольшими порциями и быстро замораживайте его, сочетая использование аэрозольного охладителя и теплоотводчика, пока вся мышца не будет полностью покрыта.Затем поместите теплоотвод сверху на блок ткани и подождите пять минут перед началом изготовления срезов. Теперь образец готов к установке на головку микротома. Сначала затяните ручку, чтобы зафиксировать диск.Убедитесь, что диск с образцом плотно прилегает к головке держателя, пока температура в камере не достигнет диапазона от -24 до -20 °C. Когда камера достигнет заданной температуры, установите толщину среза 7 мкм и начните обрезку блока. Для перемещения блока используйте грубый и точный винты фокусировки.Когда срезы будут готовы к сбору, прижмите их верхней стороной к положительно заряженным предметным стеклам, подогретым на лампе. При правильном замораживании поверхность ткани должна иметь мелово-белый цвет. Однако ткань, которая была заморожена неправильно или оттаяла в процессе монтажа, будет иметь красный или розовый оттенок.Предметные стекла можно хранить в морозильной камере для последующего анализа. Среднюю часть брюшка ткани можно определить, измерив площадь поперечного сечения на изображениях, полученных с помощью фазово-контрастной микроскопии, используя функцию обводки в пакете программного обеспечения для анализа изображений. Данный анализ позволяет определить как площадь, так и минимальный диаметр Ферре.Когда эти измерения начнут выходить на плато, значит, достигнута срединная часть брюшной полости. Хотя производители предоставляют пошаговые инструкции для большинства протоколов окрашивания, может потребоваться индивидуальная оптимизация для достижения оптимальной интенсивности окрашивания. ОКТ удалять не требуется.Для обеспечения оптимального иммуноокрашивания обязательно используйте увлажненную камеру. Она должна быть накрыта перфилмом, помещена на влажное бумажное полотенце и герметично закрыта в небольшом боксе, чтобы предотвратить высыхание срезов. В процессе окрашивания препаратов для постоянных препаратов без иммуноокрашивания, согласно протоколу окрашивания, проведите дегидратацию предметных стекол, используя серию спиртовых растворов возрастающей концентрации.Поскольку смола для заключения несмываема водой, следует очистить предметные стекла, выдержав их в течение пяти минут в 100% ксилоле. Это гарантирует, что стекла не станут матовыми со временем. Затем приступают к заключению и микроскопированию срезов средней части брюшка передних большеберцовых мышц, которые были окрашены.С использованием гематилина и эозина. Срезы, прошедшие правильную обработку, будут иметь однородную морфологию и равномерное окрашивание; при этом неправильно обработанные мышцы, подвергшиеся повреждению при замораживании или преждевременному оттаиванию, характеризуются многочисленными разрывами морфологических структур и выглядят как измельченные пшеничные хлопья.На этих срезах также была проведена иммуногистохимия. Результаты окрашивания были удовлетворительными. Фибронектин окрашен в зеленый цвет, а DAPI виден в синем.После просмотра этого видео вы должны получить полное представление о том, как подготовить качественный замороженный срез биоптата мышц для оценки архитектуры мышечной ткани. При должном освоении этой методики выполнение всех этапов в правильной последовательности занимает примерно четыре-пять часов. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости предотвращения размораживания мышечной ткани после завершения процесса.Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о росте и регенерации, могут быть применены другие методы, такие как иммуноокрашивание и гибридизация in situ.

do-s-don-ts-preparation-muscle-cryosections-for-histological

Research

JoVE Journal

Medicine

Медицина

Продемонстрированный в этом видео-методы для флеш-замораживания и секционирования эмбриональной ткани мозга от мыши. Полезные советы по использованию криостат даны, в том числе способы устранения неполадок, которые могут использоваться при резке, чтобы результирующая разделах ткани без трещин и других искажений.

Флэш Замораживание и Cryosectioning E12.5 мозга мыши

В этом видео описывается процедура мгновенной заморозки мышечной ткани и получения ее тонких участков. Этот метод может помочь в изучении связанной с раком кахексии на мышиных моделях рака толстой кишки.

Мгновенная заморозка мышечной ткани для разреза: протокол получения ультратонких срезов быстро замороженной мышечной ткани мыши

Анализ скелетных мышечных тканей для определения структурных, функциональных и биохимических свойств значительно облегчается соответствующей подготовкой.  В этом протоколе описываются соответствующие методы подготовки скелетной мышечной ткани для широкого спектра исследований фенотипирования.

Ткань Сортировка и морозильные моделей скелетных мышечных заболеваний

В этой рукописи мы представляем высокопроизводительную, полуавтоматическую криогистологическую платформу для создания выровненных составных изображений множественных мер отклика из нескольких раундов флуоресцентной визуализации на замороженных срезах минерализованных тканей.

Высокая пропускная способность, Multi-Image Cryohistology минерализованных ТКАНЕЙ

Эта рукопись описывает подробный протокол, чтобы вызвать острый скелетной регенерации мышц у взрослых мышей и последующих манипуляций мышц, таких как рассечение, замораживание, разделка, рутинного окрашивания и мышечное волокно поперечного сечения анализа площади.

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Последовательные криопроводники секции собираются для того, чтобы гистологические приложений и обогащение РНК для измерения экспрессии генов с использованием соседних областей от одной мыши скелетных мышц. Высококачественная РНК получают из 20 - 30 мг объединенных криосрезах и измерений непосредственно сопоставлены между приложениями.

Cryosectioning соприкасающихся регионов скелетной мышцы одной мыши для экспрессии генов и гистологических анализов

Этот протокол описывает процедуру, чтобы заморозить мышечную ткань, погружая их непосредственно в жидкий азот. Этот протокол также подчеркивает новый криопробирку, которые могут избежать «эффекта» веерной газообразного азота, когда жидкость контактирует азота поверхность ткани образца.

Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот

Активная аутофагия связана с продуктивной регенерацией мышц, которая необходима для активации мышечной стволовой клетки (MuSC). Здесь мы предоставляем протокол для обнаружения in situ LC3, маркера аутофагии в MyoD-положительных MuSCs участков мышечной ткани у контрольных и раненых мышей.

In Situ Иммунофлуоресцентное окрашивание аутофагии в мышечных клетках

Описано здесь протокол для прямой иммуномаркировки некротических миофибы в мышечных криосекциях. Некротические клетки проницаемы белками сыворотки, включая иммуноглобулин G (IgG). Выявление поглощения IgG миофибарами позволяет идентификации и количественной оценки миофидеров, которые проходят некроз независимо от состояния мышц.

Иммуномаркировка дегенерации миофибра при биопсии мышц

Этот протокол описывает методы, используемые для подготовки голосовых складок крыс к гистохимическому нервно-мышечному исследованию.

Подготовка голосовой складки крысы к нервно-мышечному анализу

Все больше доказательств указывает на то, что чрезмерная инфильтрация липидов внутри скелетных мышц приводит к липотоксичности и диабету. Здесь мы представляем полный протокол, включая обработку тканей, окрашивание с помощью Bodipy, получение изображений и анализ, для количественной оценки размера, плотности и субклеточного распределения липидных капель специфическим для типа волокна способом.

Тип волокна и субклеточный специфический анализ содержания липидных капель в скелетных мышцах

Узнайте методы подготовки криосрезов мышечных биоптатов для гистологического анализа с минимизацией артефактов замораживания. Быстрое замораживание и правильное встраивание обеспечивают сохранение структуры ткани.

И что нельзя делать в подготовке мышц криосрезы для гистологического анализа

Больше видео