Бестимусным Крыса модель для оценки инженерных передней крестообразной связки трансплантатов
26 марта 2015 г.
Животные модели являются важными инструментами для оценки тканеинженерных трансплантатов. В данной работе представлен протокол подготовки электроспиннингового биодеградируемого полимерного трансплантата для использования в тканевой инженерии передней крестообразной связки, а также хирургический протокол имплантации в модель крысы.
Общая цель следующей процедуры заключается в использовании модели грызуна для оценки тканеинженерных трансплантатов для замены передней крестообразной связки. Это достигается путем первоначального изготовления биоразлагаемого полимерного каркаса. На втором этапе каркас имплантируют в коленный сустав крысы.
Через 16 недель сформированные из скаффолда неосвязки извлекают для гистологического анализа. В конечном итоге тестируют биомеханическую прочность коллагена, чтобы оценить качество этих биоинженерных трансплантатов для использования при реконструкции ПКС. Основными преимуществами данного метода по сравнению с другими способами оценки скаффолдов являются то, что эта модель подвергает скаффолд воздействию сложной среды in vivo, оставаясь при этом экономически эффективной и более простой в обращении, чем модели на крупных животных.
Эта модель может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, например, каким образом созданный искусственно каркас будет интегрироваться в среду in vivo для формирования неолигамента? Данный метод может привести к созданию новых способов лечения и реконструкции ПКС. Поскольку модели на мелких животных являются первым шагом к клиническому применению, этот метод может быть использован для оценки нашего конкретного каркаса.
Данный метод также может быть применен к другим тканеинженерным конструкциям, например, содержащим клетки и факторы роста. Мы оптимизировали хирургическую технику, модифицировав методы, используемые доктором Скоттом Родео и его коллегами в Больнице специальной хирургии (Hospital for Special Surgery) в Нью-Йорке. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы электроспиннинга и хирургического вмешательства может быть сложно освоить только по письменным инструкциям.
Для электроспиннинга скаффолдов из поликапролактона потребуется большой акриловый бокс с точками ввода исходного раствора поликапролактона. Внутри вытяжного шкафа должны быть размещены collecting mandrel с электроприводом и вакуумный порт, подключенный к источнику напряжения, которые будут обеспечивать изолированную вакуумную среду для процесса электроспиннинга. Перед началом процедуры тщательно очистите бокс 70% ethanol и покройте все поверхности листами парафильма, чтобы удалить любые загрязнения, которые могут повлиять на качество полученного продукта электроспиннинга.
Затем включите вентилятор и залейте 3 мл свежеприготовленного полимера поликапролактона в шприц объемом 10 мл с тупоконечной иглой 18 G. После удаления пузырьков воздуха зафиксируйте шприц в программируемом дозаторе и вставьте иглу в акриловый бокс через входное отверстие так, чтобы примерно 1,27 см иглы оставалось снаружи бокса. Далее плотно оберните вращающийся токарный сердечник узкой полоской алюминиевой фольги и закрепите сердечник в моторе с противоположной стороны бокса, примерно в 15 см от иглы шприца, чтобы он служил коллектором; в вакуумный порт вставьте пластический шланг.
Затем подсоедините шланг к источнику вакуума в вытяжном шкафу и включите его. Теперь накройте акриловый бокс крышкой и установите скорость инфузии на программируемом шприцевом насосе на 2.5 milliliters per hour. После этого заземлите отрицательный вывод, включите двигатель, чтобы обеспечить вращение мандреля со скоростью 3, 450 RPM, и с помощью зажима «крокодил» подсоедините положительный вывод источника напряжения к кончику иглы снаружи бокса.
Как только начнется введение раствора поликапролактона, включите источник напряжения и установите рабочее напряжение 20 kilovolt. Через 12 минут введения из 0.5 milliliters раствора поликапролактона сформируется однородная манжета. Выключите все оборудование, включая источник напряжения, мотор, вакуумный насос и шприцевой насос.
Снимите оправку с двигателя, снимите полимерную манжету с оправки и сделайте один поперечный разрез, чтобы получить прямоугольный электроспиннинговый мат. Затем с помощью лазерной резки разделите мат на несколько маленьких листов, которые впоследствии нарезают на полоски, складывают в четыре слоя и сшивают между собой для создания скаффолдов перед началом операции. Сначала убедитесь в достаточности анестезии по отсутствию реакции на давление на заднюю стопу.
Затем сделайте вертикальный разрез длиной два сантиметра медиальнее колена, центрированный на уровне надколенника, при необходимости раздвигая кожу латерально. Далее с помощью скальпеля выполните медиальную парапателлярную артротомию непосредственно медиальнее надколенника, extending проксимально до уровня мышечно-сухожильного соединения четырехглавой мышцы и дистально до уровня прикрепления связки надколенника к бугристости большеберцовой кости. Теперь сделайте вертикальный разрез длиной один сантиметр через капсулу коленного сустава латеральнее связки надколенника, чтобы сместить надколенник латерально.
Затем, убедившись, что колено выпрямлено, проведите тонкие ножницы под надколенником со стороны латерального мыщелка к медиальному и несколько раз раскройте их, чтобы при сгибании колена разгибательный аппарат можно было сместить в любую сторону. Сместите надколенник латерально, чтобы открыть внутреннюю часть коленного сустава, убедившись в четкой визуализации межмыщелковой ямки и мыщелков бедренной кости. После этого перережьте ACL и PCL в области ямки.
Теперь поместите кончик K-проволоки диаметром 1.6 мм, закрепленной в электрической дрели, в точку прикрепления ПКС в межмыщелковой ямке и произведите сверление в суперлатеральном направлении, пока ассистент стабилизирует колено. Затем несколько раз введите и выведите K-проволоку, чтобы убедиться в беспрепятственном прохождении трансплантата. Визуализируйте точку выхода на латеральной поверхности бедренной кости, при необходимости удаляя скальпелем мягкие ткани.
Когда канал будет очищен, поместите спицу Киршнера в место прикрепления ПКС на плато большеберцовой кости и произведите боковое сверление, пока ассистент стабилизирует колено. Затем определите точку выхода на переднелатеральной проксимальной части большеберцовой кости, используя скальпель для очистки мягких тканей по мере необходимости, чтобы точка выхода спицы Киршнера из большеберцовой кости была полностью видна, и проведите укороченную иглу Кита длиной не более двух дюймов через бедренный костный канал. Теперь проденьте два конца нитей с одного конца трансплантата в ушко иглы и с помощью иглы протяните один конец трансплантата через бедренный канал.
Затем с помощью иглы и шовного материала Vicryl 4-0 проведите другой конец трансплантата через большеберцовый канал. Далее зафиксируйте бедренный конец трансплантата к окружающим мягким тканям восьмообразным швом, удерживая колено в разгибании для создания ручного натяжения трансплантата. Используйте еще один восьмообразный шов для фиксации большеберцового конца трансплантата к окружающим мягким тканям, после чего обрежьте излишки трансплантата с обоих концов ножницами, оставив по 1–2 мм за швом с каждой стороны.
В завершение разогните колено и проведите репозицию надколенника. Затем, используя шовный материал Vicryl 4-0, наложите один восьмиобразный шов для закрытия медиальной капсулы сустава, чтобы предотвратить латеральный подвывих надколенника, и зашейте кожу непрерывным внутрикожным швом Monocryl или Vicryl 5-0. Через 16 недель после реконструкции гистологический анализ срезов коленного сустава показывает, что матрикс скаффолда в значительной степени инфильтрируется фибробластами, секретирующими эозинофильный коллаген с хорошей интеграцией в костные каналы.
В данном эксперименте биомеханические свойства сустава оценивали сразу после забития животных. Все протестированные образцы разрушались в средней части вещества; для этого использовали кривые малых смещений, полученные в результате испытаний на растяжение. Для каждой группы рассчитывали нагрузку при разрушении и жесткость.
Через 16 недель после имплантации пиковая нагрузка и жесткость полимерного трансплантата, изготовленного методом электроспиннинга, примерно вдвое превысили показатели трансплантата, протестированного сразу после имплантации. Несмотря на это, данные значения все еще оставались ниже, чем у нативного ПКС. После освоения техники операция на животном может быть выполнена примерно за 15 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости качественного закрытия раны, при котором швы не должны быть видны снаружи.
После выполнения данной процедуры можно провести другие виды конечного анализа, такие как дополнительное окрашивание и биохимические тесты. Этот метод открыл исследователям в области тканевой инженерии возможность оценивать различные варианты трансплантатов для реконструкции ПКС. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить полимерный скаффолд для имплантации в моделе реконструкции ПКС у грызунов.
Не забывайте, что работа с живыми животными может быть опасной, и при выполнении данной процедуры необходимо постоянно соблюдать меры предосторожности, такие как следование ветеринарным рекомендациям и использование средств индивидуальной защиты.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол оценки тканеинженерных трансплантатов с использованием модели грызунов для замены передней крестообразной связки (ПКС). В работе подробно описаны процесс изготовления биодеградируемого полимерного каркаса и его имплантация в коленный сустав крысы с последующим гистологическим анализом через 16 недель.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Биомеханика
- Ортопедическая хирургия
Теоретические сведения
- Модели животных имеют решающее значение для тестирования тканеинженерных трансплантатов.
- Биоразлагаемые полимеры, полученные методом электропрядения, являются перспективными для реконструкции ПКС.
- Оценка in vivo позволяет получить представление о функциональных характеристиках скаффолда.
- Модели грызунов экономически эффективны и проще в содержании, чем более крупные животные.
Цель исследования
- Изготовление биоразлагаемого полимерного каркаса для замены передней крестообразной связки (ПКС).
- Оценка эффективности каркаса на модели крысы.
- Оценка биомеханической прочности неосвязок, сформированных на основе каркаса.
Используемые методы
- Изготовление биодеградируемого полимерного скаффолда методом электроспиннинга.
- Имплантация скаффолда в коленный сустав модели крысы.
- Извлечение неолигаментов через 16 недель для последующего анализа.
- Гистологическое и биомеханическое тестирование для оценки качества трансплантата.
Основные результаты
- Успешное изготовление и имплантация биоразлагаемого каркаса.
- Формирование неосвязок, наблюдавшееся через 16 недель.
- Гистологический анализ выявил перспективную интеграцию тканей.
- Биомеханическое тестирование показало достаточную прочность для реконструкции ПКС.
Выводы
- Модель на грызунах позволяет эффективно оценивать тканеинженерные трансплантаты.
- Биоразлагаемые полимерные скаффолды демонстрируют потенциал для восстановления ПКС.
- Данный метод представляет собой экономически выгодную альтернативу моделям на более крупных животных.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
В данном протоколе представлена воспроизводимая модель на грызунах для оценки трансплантатов передней крестообразной связки, созданных методами тканевой инженерии, что позволяет устранить критический пробел в доклинической валидации подходов регенеративной медицины. Обеспечивая возможность оценки интеграции скаффолда, формирования неосвязки и биомеханических характеристик в экономически эффективной системе, данная модель способствует раннему снижению рисков при разработке стратегий восстановления ПКС перед проведением исследований на более крупных животных или клинических испытаний. Модель позволяет получить представление о механизмах взаимодействия трансплантата с тканями реципиента, что помогает принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки в рамках технологических процессов тканевой инженерии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать биосовместимость и биоразлагаемость каркаса в среде живого сустава.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированную платформу для оценки эффективности ксеногенных трансплантатов с засеянными клетками без влияния факторов иммунного отторжения.
- Прогностическая ценность: способствует валидации функциональных мишеней путем корреляции структурных свойств трансплантата с результатами на уровне тканей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные гистологические и биомеханические показатели для оценки качества трансплантата.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые показатели формирования неосвязки через 16 недель для сравнительного скрининга скаффолдов.
- Готовность анализа: определяет нагрузку при разрыве и жесткость в качестве основных зависимых переменных для оценки эффективности инженерного трансплантата.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует инфильтрацию коллагена и отложение эозинофильного матрикса в качестве биомаркеров интеграции трансплантата.
- Практическая ценность: позволяет проводить прямое сравнение имплантированных трансплантатов с контрольными нативными ПКС на противоположной стороне для оценки прогресса с учетом рисков.
- Прогностическая достоверность: измеряет зависящее от времени биомеханическое улучшение, демонстрируя двукратное увеличение пиковой нагрузки и жесткости на 16-й неделе по сравнению с периодом сразу после имплантации.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, поддерживая проверку гипотез относительно параметров дизайна скаффолда и позволяя проводить количественное сравнение итераций трансплантатов до этапа идентификации ведущего кандидата.
- Биология открытий: Изучение того, как скаффолды из электропряденого поликапролактона интегрируются в среду in vivo для формирования неосвязок.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированного гистологического анализа инфильтрации фибробластов и секреции коллагена через 16 недель.
- Аналитика: Получение данных испытаний на растяжение для расчета нагрузки при разрыве и жесткости в качестве количественных конечных точек.
- Трансляционные исследования: Установление связи между эффективностью скаффолда и формированием неосвязки для обеспечения преклинической преемственности.
- Корпоративное повторное использование: Создание воспроизводимой модели на грызунах для оценки различных вариантов тканеинженерных трансплантатов, включая варианты с клетками и факторами роста.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в процессе интеграции трансплантата с реципиентом за счет прямой визуализации инфильтрации тканей.
- Операционная ценность: Предлагает экономически эффективную и технически доступную альтернативу моделям на крупных животных для итерационной оценки скаффолдов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, позволяя принимать решения о продолжении или прекращении разработки на ранних этапах на основе биомеханических и гистологических пороговых значений.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию кандидатов на трансплантацию с учетом рисков посредством стандартизированной оценки результатов через 16 недель.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области электроспиннинга, методах хирургических операций на грызунах и послеоперационной гистологической обработки.
- Необходима установка для электроспиннинга с контролем напряжения, вращающимся сердечником и системой вакуумной интеграции в вытяжном шкафу.
- Требуется стандартизация методов наложения швов и контроль натяжения для обеспечения единообразности имплантации трансплантата.
- Предусматриваются особенности адаптации для ксеногенных трансплантатов с засевом клетками и систем доставки факторов роста.
- Ограничено конечной точкой в 16 недель, что может не позволить зафиксировать долгосрочное ремоделирование трансплантата или механизмы его отторжения.
