Бестимусным Крыса модель для оценки инженерных передней крестообразной связки трансплантатов

Общая цель следующей процедуры заключается в использовании модели грызуна для оценки тканеинженерных трансплантатов для замены передней крестообразной связки. Это достигается путем первоначального изготовления биоразлагаемого полимерного каркаса. На втором этапе каркас имплантируют в коленный сустав крысы.

Через 16 недель сформированные из скаффолда неосвязки извлекают для гистологического анализа. В конечном итоге тестируют биомеханическую прочность коллагена, чтобы оценить качество этих биоинженерных трансплантатов для использования при реконструкции ПКС. Основными преимуществами данного метода по сравнению с другими способами оценки скаффолдов являются то, что эта модель подвергает скаффолд воздействию сложной среды in vivo, оставаясь при этом экономически эффективной и более простой в обращении, чем модели на крупных животных.

Эта модель может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, например, каким образом созданный искусственно каркас будет интегрироваться в среду in vivo для формирования неолигамента? Данный метод может привести к созданию новых способов лечения и реконструкции ПКС. Поскольку модели на мелких животных являются первым шагом к клиническому применению, этот метод может быть использован для оценки нашего конкретного каркаса.

Данный метод также может быть применен к другим тканеинженерным конструкциям, например, содержащим клетки и факторы роста. Мы оптимизировали хирургическую технику, модифицировав методы, используемые доктором Скоттом Родео и его коллегами в Больнице специальной хирургии (Hospital for Special Surgery) в Нью-Йорке. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы электроспиннинга и хирургического вмешательства может быть сложно освоить только по письменным инструкциям.

Для электроспиннинга скаффолдов из поликапролактона потребуется большой акриловый бокс с точками ввода исходного раствора поликапролактона. Внутри вытяжного шкафа должны быть размещены collecting mandrel с электроприводом и вакуумный порт, подключенный к источнику напряжения, которые будут обеспечивать изолированную вакуумную среду для процесса электроспиннинга. Перед началом процедуры тщательно очистите бокс 70% ethanol и покройте все поверхности листами парафильма, чтобы удалить любые загрязнения, которые могут повлиять на качество полученного продукта электроспиннинга.

Затем включите вентилятор и залейте 3 мл свежеприготовленного полимера поликапролактона в шприц объемом 10 мл с тупоконечной иглой 18 G. После удаления пузырьков воздуха зафиксируйте шприц в программируемом дозаторе и вставьте иглу в акриловый бокс через входное отверстие так, чтобы примерно 1,27 см иглы оставалось снаружи бокса. Далее плотно оберните вращающийся токарный сердечник узкой полоской алюминиевой фольги и закрепите сердечник в моторе с противоположной стороны бокса, примерно в 15 см от иглы шприца, чтобы он служил коллектором; в вакуумный порт вставьте пластический шланг.

Затем подсоедините шланг к источнику вакуума в вытяжном шкафу и включите его. Теперь накройте акриловый бокс крышкой и установите скорость инфузии на программируемом шприцевом насосе на 2.5 milliliters per hour. После этого заземлите отрицательный вывод, включите двигатель, чтобы обеспечить вращение мандреля со скоростью 3, 450 RPM, и с помощью зажима «крокодил» подсоедините положительный вывод источника напряжения к кончику иглы снаружи бокса.

Как только начнется введение раствора поликапролактона, включите источник напряжения и установите рабочее напряжение 20 kilovolt. Через 12 минут введения из 0.5 milliliters раствора поликапролактона сформируется однородная манжета. Выключите все оборудование, включая источник напряжения, мотор, вакуумный насос и шприцевой насос.

Снимите оправку с двигателя, снимите полимерную манжету с оправки и сделайте один поперечный разрез, чтобы получить прямоугольный электроспиннинговый мат. Затем с помощью лазерной резки разделите мат на несколько маленьких листов, которые впоследствии нарезают на полоски, складывают в четыре слоя и сшивают между собой для создания скаффолдов перед началом операции. Сначала убедитесь в достаточности анестезии по отсутствию реакции на давление на заднюю стопу.

Затем сделайте вертикальный разрез длиной два сантиметра медиальнее колена, центрированный на уровне надколенника, при необходимости раздвигая кожу латерально. Далее с помощью скальпеля выполните медиальную парапателлярную артротомию непосредственно медиальнее надколенника, extending проксимально до уровня мышечно-сухожильного соединения четырехглавой мышцы и дистально до уровня прикрепления связки надколенника к бугристости большеберцовой кости. Теперь сделайте вертикальный разрез длиной один сантиметр через капсулу коленного сустава латеральнее связки надколенника, чтобы сместить надколенник латерально.

Затем, убедившись, что колено выпрямлено, проведите тонкие ножницы под надколенником со стороны латерального мыщелка к медиальному и несколько раз раскройте их, чтобы при сгибании колена разгибательный аппарат можно было сместить в любую сторону. Сместите надколенник латерально, чтобы открыть внутреннюю часть коленного сустава, убедившись в четкой визуализации межмыщелковой ямки и мыщелков бедренной кости. После этого перережьте ACL и PCL в области ямки.

Теперь поместите кончик K-проволоки диаметром 1.6 мм, закрепленной в электрической дрели, в точку прикрепления ПКС в межмыщелковой ямке и произведите сверление в суперлатеральном направлении, пока ассистент стабилизирует колено. Затем несколько раз введите и выведите K-проволоку, чтобы убедиться в беспрепятственном прохождении трансплантата. Визуализируйте точку выхода на латеральной поверхности бедренной кости, при необходимости удаляя скальпелем мягкие ткани.

Когда канал будет очищен, поместите спицу Киршнера в место прикрепления ПКС на плато большеберцовой кости и произведите боковое сверление, пока ассистент стабилизирует колено. Затем определите точку выхода на переднелатеральной проксимальной части большеберцовой кости, используя скальпель для очистки мягких тканей по мере необходимости, чтобы точка выхода спицы Киршнера из большеберцовой кости была полностью видна, и проведите укороченную иглу Кита длиной не более двух дюймов через бедренный костный канал. Теперь проденьте два конца нитей с одного конца трансплантата в ушко иглы и с помощью иглы протяните один конец трансплантата через бедренный канал.

Затем с помощью иглы и шовного материала Vicryl 4-0 проведите другой конец трансплантата через большеберцовый канал. Далее зафиксируйте бедренный конец трансплантата к окружающим мягким тканям восьмообразным швом, удерживая колено в разгибании для создания ручного натяжения трансплантата. Используйте еще один восьмообразный шов для фиксации большеберцового конца трансплантата к окружающим мягким тканям, после чего обрежьте излишки трансплантата с обоих концов ножницами, оставив по 1–2 мм за швом с каждой стороны.

В завершение разогните колено и проведите репозицию надколенника. Затем, используя шовный материал Vicryl 4-0, наложите один восьмиобразный шов для закрытия медиальной капсулы сустава, чтобы предотвратить латеральный подвывих надколенника, и зашейте кожу непрерывным внутрикожным швом Monocryl или Vicryl 5-0. Через 16 недель после реконструкции гистологический анализ срезов коленного сустава показывает, что матрикс скаффолда в значительной степени инфильтрируется фибробластами, секретирующими эозинофильный коллаген с хорошей интеграцией в костные каналы.

В данном эксперименте биомеханические свойства сустава оценивали сразу после забития животных. Все протестированные образцы разрушались в средней части вещества; для этого использовали кривые малых смещений, полученные в результате испытаний на растяжение. Для каждой группы рассчитывали нагрузку при разрушении и жесткость.

Через 16 недель после имплантации пиковая нагрузка и жесткость полимерного трансплантата, изготовленного методом электроспиннинга, примерно вдвое превысили показатели трансплантата, протестированного сразу после имплантации. Несмотря на это, данные значения все еще оставались ниже, чем у нативного ПКС. После освоения техники операция на животном может быть выполнена примерно за 15 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости качественного закрытия раны, при котором швы не должны быть видны снаружи.

После выполнения данной процедуры можно провести другие виды конечного анализа, такие как дополнительное окрашивание и биохимические тесты. Этот метод открыл исследователям в области тканевой инженерии возможность оценивать различные варианты трансплантатов для реконструкции ПКС. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как изготовить полимерный скаффолд для имплантации в моделе реконструкции ПКС у грызунов.

Не забывайте, что работа с живыми животными может быть опасной, и при выполнении данной процедуры необходимо постоянно соблюдать меры предосторожности, такие как следование ветеринарным рекомендациям и использование средств индивидуальной защиты.