Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением На месте Гибридизация

Общая цель данного эксперимента — обнаружить случайно локализованные мРНК в образцах мозга взрослого человека. Это достигается за счет предварительной обработки. Образцы путем кипячения и расщепления протеазы для демаскирования молекул мРНК в качестве второго этапа выполняется гибридизация, за которой следуют этапы амплификации и детектирования, которые позволяют визуализировать интересующую мРНК.

Затем аксоны окрашивают антителами или красителями для того, чтобы убедиться, что интересующая мРНК локализована в аксонах. Результаты показывают наличие TF 4 мРНК в образцах мозга с использованием различных процедур демаскирования и счетчиков, методов окрашивания, основанных на микроскопических анализах. Этот метод может помочь ответить на вопросы нейробиологии, например, какие мРНК локализованы и транслируются без экзонов.

Хотя этот метод может дать представление о синтезе внутримозгового белка, он также может быть применен к другим системам, таким как дендриты и ненейрональные клетки и ткани, в которых происходит локализация мРНК. После фиксации срезов мозга, согласно инструкции в письменном протоколе, приготовьте банку с копином, содержащую 60 миллилитров раствора для извлечения антигена, и погрузите в раствор предметные стекла. Затем наполните литровый стакан дистиллированной водой и поместите его в микроволновую печь, чтобы буферизировать тепло.

При выполнении демаскировки поместите банку коплана, содержащую предметные стекла и раствор для извлечения, в микроволновую печь. Варите горки на высокой мощности в течение пяти минут. Сразу после того, как раствор перестанет кипеть, нагревайте горки снова на высокой мощности еще на пять минут.

Дайте предметным стеклам остыть при комнатной температуре После охлаждения погрузите предметные стекла в посуду, содержащую PBS, чтобы вымыть их, а затем повторите промывку еще два раза После мытья поместите слайды на ровную поверхность и добавьте две-три капли или 100 микролитров DAP B. Зондируйте на два или три участка мозга в качестве контроля. Чтобы оценить фоновое окрашивание, добавьте две-три капли зонда-нацеливания в экспериментальные срезы Для обнаружения интересующей РНК используется зонд, нацеленный на остатки от 20 до 1381 мыши. С помощью щипцов поместите параметр на предметные стекла, чтобы избежать испарения зонда.

Затем поместите предметные стекла во увлажненную ползунковую коробку в печь для гибридизации и инкубируйте их при температуре 40 градусов Цельсия в течение двух часов. По истечении времени инкубации вымойте предметные стекла в посуде с одним буфером для промывки в течение двух минут при комнатной температуре. Далее добавьте две-три капли реактива для усиления МП по одной фл на каждый срез мозга.

Затем накрываем свежей пара-пленкой, помещаем в слайд-бокс и выдерживаем при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут в печи для гибридизации. После промывки предметных стекол, как и раньше, добавьте две-три капли усилительного реактива А МП четыре фл на каждый срез мозга и накройте перфилом. Инкубируйте предметные стекла в слайд-боксе при температуре 40 градусов Цельсия в течение 15 минут в печи для гибридизации.

Промойте слайды дважды одним буфером для стирки в течение двух минут при комнатной температуре. Как и до последней промывки, накройте каждый срез 100-200 микролитрами блокирующего раствора, содержащего три миллиграмма на миллилитр BSA 100 миллимолярного глицина и 0,25% Triton X 100 в PBS, накройте каждое предметное стекло параформой и инкубируйте в течение 30 минут При комнатной температуре после инкубации добавьте от 100 до 200 микролитров антител, разведенных в блокирующем растворе, к предметным стеклам. Здесь используется антитело против холина ацетилтрансферазы после накрытия предметных стекол перфилом для инкубации в течение двух дней при четырех градусах Цельсия.

Убедитесь, что срезы мозга не высыхают, при необходимости повторно нанесите раствор антител против CHATT на срезы мозга через 24 часа после инкубации. После промывка горок трижды в один XPBS в течение пяти минут. При комнатной температуре добавьте от 100 до 200 микролитров соответствующего конъюгированного вторичного антитела Alexa в предметные стекла.

Накройте крышкой и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре в защищенном от света месте по истечении часа. Промойте слайды три раза в одном XPBS по пять минут каждый, как и раньше, а затем промойте один раз дистиллированной водой. Закрепите предметные стекла с помощью монтажной среды, содержащей DPI, а затем визуализируйте срезы мозга под флуоресцентным микроскопом.

После подготовки формальных и фиксированных образцов мозга человека, залитых парафином, в соответствии с инструкциями в письменной части протокола, проведите индуцированную тепловым демаскированием антигена, погрузив предметные стекла в горячий предварительно обработанный два раствора и прокипятив в течение 15 минут. После промывки от трех до пяти раз в дистиллированной воде и от трех до пяти раз в свежем 100% этаноле дайте предметным стеклам высохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы выполнить демаскировку антигена, вызванную протеазой. Добавьте четыре капли предварительно обработанного, трижды накройте перфилом и выдерживайте 30 минут при температуре 40 градусов Цельсия в гибридизационной печи, предварительно промыв три-пять раз в дистиллированной воде.

Как и раньше, добавьте четыре капли набора зондов DAP B для контроля срезов мозга для оценки фонового окрашивания и четыре капли набора зондов нацеливания на экспериментальные участки. Поместите пару предметных стекол, покрытых пленкой, в предметную коробку и выдерживайте в течение двух часов при температуре 40 градусов Цельсия в печи для гибридизации. После выполнения описанных в письменном протоколе действий по разработке сигнала DAB для интересующей мРНК проверьте наличие сигнала под светлопольным микроскопом.

Определите референсные области в образцах мозга, в которых необходимо контролировать наличие точек на протяжении всей процедуры удаления пятен. Для борьбы с пятнами. Сначала поместите предметные стекла в цвет люкс быстрого синего цвета, предварительно нагретые до 60 градусов Цельсия и выдерживайте в течение 30 минут при температуре 60 градусов Цельсия.

После инкубации несколько раз промойте предметные стекла в дистиллированной воде, а затем несколько раз опустите их в 0,05% раствор карбоната лития, чтобы начать дифференцировку. Далее дважды опустите горки в свежий, 75% этанол и промойте в дистиллированной воде. Проверьте срезы мозга под светлопольным микроскопом.

Обратите внимание, что серое и белое вещество должны начать различаться, а гранулы РНК все еще должны быть видны как темно-синие, черные точки. Убедитесь, что аксоны начинают выглядеть как светло-голубые волокна, повторите процедуру окрашивания в люксальный синий цвет с шагом от 10 до 20 минут и внимательно контролируйте встречное окрашивание и наличие гранул РНК после достижения оптимального окрашивания. Поместите предметные стекла для промывки в раствор альфиалки и инкубируйте в течение 10 минут после инкубации.

Промойте горки в дистиллированной воде. Окуните предметные стекла в 70% этанол от пяти до 10 раз, а затем обезвожьте путем трех быстрых замен 100% этанола в вытяжном шкафу. Очистите срезы мозга путем двукратной инкубации в ксилоле.

Альтернативный клиринговый агент на две минуты и третий раз на пять минут. При комнатной температуре срезы мозга монтируют в постоянную среду для монтажа на основе ксилола и анализируют под микроскопом с ярким полем. Рыб проводили с использованием индуцированной протеазой демаскировки с последующим обнаружением антител к холинацетилтрансферазе, показанной красным цветом.

Антитело не смогло распознать чат при проведении лечения протеазой. Показаны примеры результатов, полученных с помощью нецелевого зонда и зонда TF с четырьмя нацеленными на них с использованием одних и тех же настроек микроскопа и корректировки изображения. Зеленые четыре положительные гранулы ATF с неясной аксональной локализацией обозначены вопросительными знаками.

Синие участки представляют собой пятнистые окрашенные ядра, когда рыба была обработана с использованием термоиндуцированного антигена. Демаскирующее чат иммунофлуоресцентное окрашивание, снова показанное красным цветом, оказалось успешным. TF: четыре положительные гранулы, локализованные по аксонам, отображаются оранжевым цветом и помечаются как нормальные, после того как аксоны были покрыты люксом.

Быстрый синий и нейрональный SOTA были встречно окрашены гребневым фиолетовым субоптимальным люксом. Быстрое окрашивание синим цветом может произойти при снижении температуры. Здесь образцы окрашивались в цвет люксового быстрого синего цвета при температуре 40 градусов Цельсия в течение четырех часов.

Четыре положительные гранулы с неясной случайной локализацией обозначены вопросительными знаками. Неоптимальное окрашивание также происходит, когда интенсивность встречного окрашивания не проверяется после коротких инкубационных периодов, как показано здесь. Здесь показаны примеры оптимального окрашивания LFB в сочетании с ish с использованием нецелевого зонда или целевого зонда TF four.

Получение изображения было автоматически настроено для достижения наилучшего соотношения сигнал/шум. Аксон локализовал ТФ, четыре гранулы помечены как нормальные. После освоения.

Эта техника может быть выполнена в течение одного-трех дней в зависимости от выбранного метода контрокрашивания после его разработки. Этот метод открывает перед нейробиологами возможность исследовать трансляцию и локализацию мРНК во всех нюансах.