Обнаружение Axonally локализованного мРНК в срезах мозга с помощью высоким разрешением

Общая цель следующего эксперимента заключается в обнаружении случайно локализованных мРНК в образцах мозга взрослых особей. Это достигается путем предварительной обработки образцов кипячением и перевариванием протеазами для демаскировки молекул мРНК; вторым этапом проводится гибридизация с последующими этапами амплификации и детекции, что позволяет визуализировать интересующую мРНК.

Затем аксоны окрашивают антителами или красителями, чтобы подтвердить локализацию интересующей мРНК в аксонах. Результаты, полученные с помощью методов окрашивания на основе микроскопического анализа, демонстрируют наличие мРНК TF four в образцах мозга при использовании различных процедур демаскировки и контрастирования. Данный метод может помочь ответить на вопросы нейробиологии, например, о том, какие мРНК локализуются и транслируются без участия экзонов.

Хотя данный метод позволяет изучить синтез белков внутри аксонов, его также можно применять к другим системам, таким как дендриты, а также к ненейрональным клеткам и тканям, в которых происходит локализация мРНК. После фиксации срезов мозга, согласно инструкциям в письменном протоколе, подготовьте копи-контейнер, содержащий 60 milliliters раствора для демаскировки антигенов, и погрузите в него стекла. Затем наполните однолитровый стакан дистиллированной водой и поместите его в микроволновую печь для стабилизации температуры.

При проведении демаскирования поместите стакан Коплан со стеклами и восстанавливающим раствором в микроволновую печь. Доведите раствор до кипения на высокой мощности и кипятите стекла в течение пяти минут. Сразу после того, как раствор перестанет кипеть, повторно нагрейте стекла на высокой мощности еще в течение пяти минут.

Дайте слайдам остыть при комнатной температуре. После охлаждения погрузите слайды в кювету с PBS для промывки, затем повторите промывку еще два раза. После промывки поместите слайды на плоскую поверхность и нанесите по две-три капли или 100 µL зонда DAP B на два-три среза мозга в качестве контроля. Для оценки фонового окрашивания нанесите две-три капли таргетного зонда на экспериментальные срезы. Для обнаружения интересующей РНК здесь используется зонд, таргетный к остаткам с 20 по 1381 РНК mouse a TF four. С помощью пинцета поместите параfilm поверх слайдов, чтобы избежать испарения зонда.

Затем поместите предметные стекла в увлажненный контейнер для стекол внутри печи для гибридизации и инкубируйте их при 40 °C в течение двух часов. По истечении времени инкубации промойте стекла в кювете с 1х промывочным буфером в течение двух минут при комнатной температуре. Затем добавьте по две-три капли реагента для амплификации AMP1FL на каждый срез мозга.

Затем накройте свежей парафильмом, поместите в кассету для предметных стекол и инкубируйте при 40 °C в течение 15 минут в гибридизационном печи. После промывки стекол, как описано ранее, добавьте две-три капли реагента для амплификации A MP four fl на каждый срез мозга и накройте парафильмом. Инкубируйте стекла в кассете при 40 °C в течение 15 минут в гибридизационном печи.

Дважды промойте предметные стекла 1x промывочным буфером по две минуты каждое при комнатной температуре. Как и прежде, после последнего промывания нанесите на каждый срез от 100 до 200 µL блокирующего раствора, содержащего 3 mg/mL BSA, 100 mM глицина и 0.25% Triton X 100 в PBS; накройте каждое стекло парафильмом и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации добавьте на стекла от 100 до 200 µL антител, разведенных в блокирующем растворе. В данном случае используются антитела к холин-ацетилтрансферазе. После того как стекла будут накрыты парафильмом, инкубируйте их в течение двух дней при 4 °C.

Следите за тем, чтобы срезы мозга не пересыхали; при необходимости повторно нанесите раствор антител к CHATT на срезы мозга через 24 часа после инкубации. После этого трижды промойте стекла в 1×PBS по пять минут. При комнатной температуре добавьте на стекла от 100 до 200 µL соответствующего вторичного антитела, конъюгированного с Alexa.

Накройте парафильмом и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. По истечении часа трижды промойте предметные стекла в 1X PBS по пять минут каждое, как и ранее, а затем однократно промойте дистиллированной водой. Закрепите срезы мозга на предметных стеклах с помощью среды для заключения, содержащей DPI, и затем визуализируйте их с помощью флуоресцентного микроскопа.

После подготовки формалиновых и фиксированных в парафине образцов человеческого мозга в соответствии с инструкциями в текстовой части протокола, проведите термоиндуцированное демаскирование антигенов, погрузив предметные стекла в горячий раствор для предварительной обработки №2 и кипятя их в течение 15 минут. После промывки от трех до пяти раз в дистиллированной воде и от трех до пяти раз в свежем 100% ethanol, оставьте стекла сохнуть в течение пяти минут при комнатной температуре для проведения протеазного демаскирования антигенов. Добавьте четыре капли раствора для предварительной обработки №3, накройте Perfil и инкубируйте в течение 30 минут при 40 °C в гибридизационном печи. После этого промойте стекла от трех до пяти раз в дистиллированной воде.

Как и прежде, добавьте четыре капли набора зондов DAP B к контрольным срезам мозга для оценки фонового окрашивания и четыре капли набора таргетных зондов к экспериментальным срезам. Поместите пару предметных стекол, накрытых пленкой, в контейнер для стекол и инкубируйте в течение двух часов при 40 °C в гибридизационном печи. После выполнения этапов письменного протокола по проявлению сигнала DAB для искомой мРНК проверьте наличие сигнала с помощью микроскопа в светлом поле.

Определите контрольные области в образцах мозга, в которых будет отслеживаться наличие пунктов на протяжении всей процедуры контрастного окрашивания. Для проведения контрастного окрашивания сначала поместите стекла в раствор Luxol Fast Blue, предварительно нагретый до 60 °C, и инкубируйте в течение 30 минут при 60 °C.

После инкубации несколько раз промойте стекла дистиллированной водой, затем несколько раз окуните их в 0,05% раствор карбоната лития для начала дифференцировки. Далее дважды окуните стекла в свежий 75% ethanol и промойте дистиллированной водой. Осмотрите срезы мозга под микроскопом в светлом поле.

Обратите внимание, что серое и белое вещества должны начать различаться, а гранулы РНК все еще должны быть видны в виде темно-синих или черных пунктирных точек. Убедитесь, что аксоны начинают проявляться в виде светло-голубых волокон; при необходимости повторите процедуру окрашивания Luxal Blue, инкубируя препарат с Luxal Blue интервалами по 10–20 минут, тщательно контролируя интенсивность контрастного окрашивания и наличие гранул РНК до достижения оптимального результата. После инкубации поместите промытые предметные стекла в раствор кристаллического фиолетового и инкубируйте в течение 10 минут.

Промойте предметные стекла в дистиллированной воде. Погрузите стекла в 70% ethanol от пяти до 10 раз, затем обезводьте путем трех быстрых смен 100% ethanol в вытяжном шкафу. Проведите просветление срезов мозга, дважды инкубируя их в ксилоле.

Повторно обработайте альтернативным осветляющим агентом в течение двух минут и в третий раз в течение пяти минут. При комнатной температуре заключайте срезы мозга в перманентный среду для заключения на основе ксилола и проанализируйте их с помощью светового микроскопа. Окрашивание рыбы проводили с использованием протеазного демаскирования с последующим определением холиноацетилтрансферазы с помощью антител, показанной красным цветом.

Антитело не распознало chat после обработки протеазой. Приведены примеры результатов, полученных с использованием нецелевого зонда и зонда, нацеленного на ATF four, при одинаковых настройках микроскопа и корректировке изображений. Зеленые ATF four-положительные гранулы с неясной аксональной локализацией отмечены вопросительными знаками.

Синие области представляют собой пятнисто окрашенные ядра после проведения окрашивания с использованием метода тепловой демаскировки антигенов. Иммунофлуоресцентное окрашивание, снова показанное красным цветом, прошло успешно. Гранулы, положительные по TF four, локализованные в аксонах, выглядят оранжевыми и отмечены как «окей»; аксоны были подвергнуты контрастированию luxal.

Контр-окрашивание Fast blue и нейронального SOTA проводили с использованием субоптимального раствора люксала с кристаллическим фиолетовым. Окрашивание Fast blue может произойти при понижении температуры. В данном случае образцы окрашивали люксалом Fast blue при 40 °C в течение четырех часов.

Четыре гранулы, положительные по TF four, с неопределенной случайной локализацией отмечены вопросительными знаками. Субоптимальное окрашивание также возникает, когда интенсивность докрашивания не проверяется после коротких периодов инкубации, как показано здесь. Здесь представлены примеры оптимального окрашивания LFB в сочетании с ish с использованием нецелевого зонда или зонда, направленного на TF four.

Сбор изображений был автоматически настроен для достижения оптимального соотношения сигнал/шум. Локализация аксонов — четыре гранулы TF отмечены как подходящие после завершения обработки.

Данный метод может быть выполнен за один-три дня в зависимости от выбранного способа докрашивания после проявления. Эта методика позволяет нейробиологам детально изучать трансляцию и локализацию мРНК.