Мышь Модель аллоиммунная-индуцированной сосудистой неприятие и трансплантации атеросклероз

Общая цель данной процедуры заключается в выполнении сквозного интерпозиционного шунтирования аорты у мышей для изучения васкулярного отторжения и трансплантационного артериосклероза. Это достигается путем предварительного забора сегмента брюшной аорты мыши-донора. Затем данный сегмент ортотопически пересаживается в интраренальный отдел аорты аллогенного реципиента, который генетически отличается от донора.

На заключительном этапе сегмент пересаженного сосуда иссекают и анализируют на предмет развития трансплантационного артериосклероза. В конечном итоге степень трансплантационного артериосклероза и иммуноопосредованного сосудистого отторжения аллографта можно оценить путем измерения утолщения интимы и сужения просвета, а также с помощью иммуногистохимического анализа ткани на предмет накопления иммунных клеток.

Как правило, специалистам, которые впервые выполняют данную процедуру, требуется время, чтобы освоить технику микрохирургии, поскольку для ее овладения необходим высокий уровень ловкости рук и многократная практика. Тем не менее, при должном усердии и опыте этот метод становится доступным для большинства исследователей. Поэтому демонстрацию процедуры проводят г-жа Винни, опытный нейрохирург, и Адам Росо, талантливый аспирант моей лаборатории. Начните с того, что поместите мышь-донора в положение на спине на чистую тонкую плексигласовую доску, обернутую стерильной салфеткой, под операционным микроскопом при 8-30-кратном увеличении.

После подтверждения достаточной хирургической анестезии с помощью щипка за палец используйте стерильные ножницы, чтобы сделать один срединный разрез от лобка до отростка ZipID. Затем с помощью небольшого ретрактора разведите стенки брюшной полости, чтобы открыть доступ к брюшной полости. После этого с помощью стерильных ватных тампонов осторожно отодвиньте кишечник краниально и влево.

Накройте ткань марлей, смоченной в физиологическом растворе, и сместите репродуктивные органы каудально, чтобы обнаружить подпочечную аорту и нижнюю полую вену (НПВ). Теперь с помощью медицинского зажима №5 отделите аорту от НПВ в области левой почечной артерии рядом с бифуркацией. Затем используйте монофиламентную полиамидную нить 10-0 для лигирования мелких ветвей вблизи аорты.

После отделения донорской аорты и нижней полой вены (НПВ) пропитайте сосуд физиологическим раствором, накройте открытую полость увлажненной марлей и поместите донора в стерильную зону. Затем поместите мышь-реципиент под микроскоп и отделите аорту реципиента от НПВ, как было показано ранее. После этого установите два четырехмиллиметровых микрососудистых зажима проксимальнее и дистальнее интересующего сегмента на расстоянии примерно 5 mm друг от друга.

Затем с помощью микроножниц из набора для сосудистых операций выполните один горизонтальный разрез аорты и резектируйте не более 0.5 millimeters брюшной аорты, чтобы подготовить место для донорского аортального трансплантата. Снова поместите донор под микроскоп и отсеките сегмент трансплантата длиной от трех до четырех millimeters, как было продемонстрировано выше. Затем с помощью иглы 25 gauge длиной пять восемь промойте иссеченную аорту гепаринизированным физиологическим раствором.

Следите за тем, чтобы кончик иглы не касался сосуда, и поместите сосуд в контейнер с гепаринизированным ледяным физиологическим раствором на льду. В течение 30 минут после иссечения поместите донорский аортальный трансплантат в ортотопическое положение реципиенту, совмещая анатомическую ориентацию трансплантата с ориентацией сосудов реципиента. Затем аккуратно захватите tunica externa сосуда и с помощью зажима номер пять слегка отведите её в сторону.

Теперь с помощью пинцета проведите иглу с полиамидным монофиламентным швом размера 10-0 сквозь всю толщину стенки сосуда, чтобы зафиксировать донорский аортальный трансплантат к резецированному сосуду реципиента для наложения непрерывных швов. Расположите фиксирующие швы на «девяти часах» как на верхнем, так и на нижнем концах трансплантата. Затем начните формирование анастомоза с верхнего конца трансплантата, начиная с «трех часов».

Соедините резецированные концы двумя непрерывными швами и закрепите шов на удерживающем шве. Затем переверните трансплантат и продолжите наложение непрерывного шва по дорсальной части сосуда до достижения места его отхождения.

Завяжите шов. Зафиксируйте шов, не оказывая сильного давления на сосуд, и повторите наложение швов для нижнего анастомоза. После завершения формирования анастомоза.

Ослабьте дистальный микрососудистый зажим, чтобы обеспечить ретроградный кровоток через сосуд. Если кровотечения не наблюдается, снимите проксимальный зажим. При отсутствии обструкции кровотока с помощью пинцета аккуратно захватите один конец удерживающих швов и слегка отведите сосуд, чтобы осмотреть его заднюю стенку.

При отсутствии сморщивания и наличии выраженной пульсации в донорском и реципиентном сосудах верните кишечник в брюшную полость с помощью ватных тампонов. В завершение, используя иглодержатель и зажим Грофа, закройте брюшную стенку полипропиленовыми нитями 5-0 непрерывным швом. Закройте слой кожи тем же шовным материалом, используя внутрикожный метод ушивания.

Для оценки успеха операции можно наблюдать за моторной функцией задних конечностей. Степень иммуноопосредованного сосудистого повреждения аллотранспланта оценивается путем количественного определения утолщения интимы и сужения просвета в трансплантированных сегментах аорты на 30-й день после трансплантации.

Как и наблюдалось, в сегментах аллографта артерии развивается значительное утолщение интимы и окклюзия просвета, тогда как в контрольных сегментах артерии с изографтом никаких изменений не обнаруживается. Кроме того, рекрутирование лейкоцитов в артерию аллографта можно оценить путем анализа накопления CD4- и CD8-положительных Т-клеток и макрофагов с помощью иммуногистохимии. Как и ожидалось, все три типа иммунных клеток были обнаружены в интиме донорских артериальных тканей после развития процесса.

Данный метод открыл исследователям в области трансплантации возможность изучить аллоиммунное опосредованное сокращение сосудов и артериальный склероз трансплантата.