Выделение и характеристика спутниковых клеток от Крыса Глава Branchiomeric мышц

Общая цель этой процедуры заключается в выделении сателлитных клеток из репрезентативных мышц, происходящих из первой, второй и четвертой плечевых дуг, для их культивирования во внеклеточном матриксе. Гелевые пятна. Это достигается путем предварительного препарирования резни, двучелюстной и левада vli нёбных мышц молодой взрослой крысы.

На втором этапе клетки-сателлиты из каждого мышечного образца выделяют по ферментативности, пищеварению и продолжительности. Затем клетки культивируются на гелях внеклеточного матрикса. В конечном счете, динамическое состояние миогенеза сателлитных клеточных культур можно отследить с помощью окрашивания на интересующие мышечные маркеры.

Заячья губа и небо является одним из наиболее распространенных видов черепно-лицевой мальформации у человека. При наличии расщелины требуется хирургическое вмешательство, чтобы закрыть дефект и обеспечить нормальное развитие речи, фиброз и дефектная регенерация мышц, однако, могут препятствовать функциональному восстановлению мышц мягкого неба. После восстановления расщелины неба Вы можете продемонстрировать инновационный метод культивирования свежевыделенных сателлитных клеток с использованием гелевых пятнистых покрытий exo cellular matrix размером всего в миллиметр.

Это позволяет избежать необходимости в расширении. И эти ячейки За сутки до изоляции места из восьмилуночной камеры вставляют в 100-миллиметровую чашку Петри и переносят чашку на холодную поверхность. Через 10 минут с помощью предварительно заполненной микропипетки введите одну каплю геля из внеклеточного матрикса объемом 10 микролитров в каждую лунку.

Охладив стекла еще семь минут, полностью удалите остатки геля и просушите лунки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи на следующий день. Чтобы вскрыть мышцу резни, снимите кожу с головы девятинедельной крысы и с помощью игл для подкожных инъекций закрепите голову на боку. На силиконовой подушечке изолируйте околоушную железу и лицевой нерв и удалите железу.

Далее с помощью лезвия скальпеля номер 15 аккуратно удалите лицевой нерв. Определите поверхностную головку жевательной мышцы. Затем с помощью прямых щипцов отделите сухожилие от его начала в скуловом отростке, после чего осторожно разрежьте сухожилие ножницами для рассечения.

С помощью скальпеля рассекают поверхностную головку бойни до ее введения под углом и нижней половиной боковой поверхности ветви нижней челюсти. Чтобы рассечь заднюю часть брюшка двужелудочной мышцы, зафиксировать голову в лежачем положении с помощью игл и удалить подкожный жир, охватывающий как подъязычные, так и подчелюстные железы. Обнажите переднюю и заднюю мышцы желудка животом, затем, удерживая переднее сухожилие заднего брюха прямыми щипцами, аккуратно разрежьте сухожилие до его начала в барабанной перепонке.

Чтобы рассечь леваду vli нёбной мышцы, локализуют зубчатую галлоидную мышцу. Потяните его в сторону и аккуратно удалите мышечную ткань. Далее локализуйте сухожилие левады вли палатино, которое вставляет в барабанную перепонку и аккуратно рассекайте его.

Затем поднимите пищевод из-за трахеи. Определите область мягкого неба, куда вставляется левада и небо, и разрежьте мышцу. Затем погрузите мышцу в 70% этанол и переведите ее в ледяной PBS с добавлением антибиотиков.

Чтобы изолировать клетки-сателлиты, перенесите каждую мышцу в отдельные лунки шестилуночной пластины, а ткани разрежьте на мелкие кусочки размером в два миллиметра. Следите за тем, чтобы не напрячь мышцы слишком сильно. Далее тщательно инкубируют фрагменты тканей в 2,5 миллилитрах 0,1%-ного раствора проназы на лунку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут с легким встряхиванием каждые 20 минут.

При поступлении клетчатки пучки А разрыхленного вида на 2,5 мл ДМЭМ дополняют лошадиной сывороткой и антибиотиками в каждую лунку и переносят переваренные ткани в отдельные 15 миллилитровые конические трубки. Открутите тканевые кашицы и сцедите надосадочную жидкость. Затем добавьте по пять миллилитров среды в каждую пробирку и гомогенизируйте ткань с помощью пластиковой пипетки объемом 10 миллилитров.

Снова раскрутите ткани вниз и перенесите надосадочную жидкость в новые конические пробирки объемом 15 миллилитров. Затем добавьте в пробирки еще пять миллилитров среды и снова трижды протрите кусочки ткани, пока фрагменты не пройдут легко через пипетку. После очередного центрифугирования вытяните надосадочную жидкость в соответствующие пробирки и отфильтруйте клеточные суспензии через 40 микрометровые сетчатые фильтры в отдельные пробирки объемом 50 миллилитров.

Промойте ситечки одним миллилитром DMEM для максимального восстановления клеток. Затем раскрутите клетки, повторно суспендируйте гранулы в свежей, средней и подсчитайте клетки для культивирования выделенных клеток-сателлитов. Далее разбавляют клеточные суспензии в соотношении 1,5 раза по 10 к трем клеткам на 10 мк питательной среды.

Затем добавьте 10 микролитров клеток на каждое предварительно подготовленное гелевое пятно внеклеточного матрикса и инкубируйте гели при температуре 37 градусов Цельсия через шесть часов. Осторожно добавьте 400 микролитров питательной среды в каждое гелевое пятно и верните предметные стекла в инкубатор. Через три дня сразу после выделения следует инициировать дифференцировку клеток с добавлением соответствующей питательной среды.

Более 90% свежевыделенных клеток-сателлитов экспрессируют Pack 7 К четвертому дню Pack 7 и MyoD экспрессируются сателлитными клетками из всех групп мышц. Моя ОГ сильно выражена на седьмой день во всех группах мышц. Через четыре дня после посева на внеклеточный матрикс, гелевые пятна, пролиферирующие клетки начинают сливаться и образовывать небольшие многоядерные миотрубки, которые экспрессируют тяжелую цепь миозина на седьмой и 10-й день.

Длинные и хорошо организованные миотрубки заметны к 10-му дню. Также может наблюдаться подергивание миотруба. Этот протокол позволяет изучать сателлитные клетки, происходящие из мышц головы, и предлагает новые возможности для лечения расщелины пальца. Пациентов.