Экс естественных изображений послеродовой мозжечка ЗК миграции с помощью конфокальной макроскопии

Общая цель этой процедуры — визуализировать мигрирующие нейроны в живых срезах мозга. Это достигается путем предварительного вскрытия мозжечка у крысы P 10. Следующими шагами являются приготовление острых срезов мозжечка и маркировка нейронов флуоресцентным зондом.

Затем проводится покадровая съемка с помощью макроконфокальной визуализации или конфокальной микроскопии. Последним шагом является отслеживание нейронов в полученных фильмах. В конечном счете, микроскопия ex vivo используется для того, чтобы показать роль эндогенных факторов или токсичных веществ, которые регулируют миграцию нейронов.

Основным преимуществом этой методики по сравнению с существующими методами, такими как конфокальная микроскопия, является то, что макроконфокальная визуализация увеличивает ощущение вида при оставлении срезов мозгового искусства непосредственно на паховой вставки. Сначала у меня возникла идея этого метода, когда у меня возникли трудности с переносом и стабилизацией мозговых срезов для экспериментов с конфокальной микроскопией. Начните с доступа к черепу обезглавленного щенка крысы P 10, используя тонкие ножницы радужной оболочки, аккуратно сделайте два боковых разреза от основания к ростральной области черепа. Затем удалите рассеченный череп двумя щипцами номер три, разорвав любое сцепление между мозгом и черепом.

Теперь выньте мозг концом лопатки и положите его в 35-миллиметровую чашку Петри с двумя миллилитрами холодного HBSS на льду. Теперь под стереомикроскопом изолируйте мозжечок от мозга с помощью D рваных ран с помощью двух щипцов номер три. Выложите мозжечок в новую посуду с ледяным буфером.

Затем с помощью тех же инструментов удалите и выбросьте остаточный спинной мозг и отслаивающуюся мембрану. Подготовьте прочную рукоятку скальпеля номер три с хирургическим лезвием номер 15. С помощью лезвия под стереомикроскопом разрежьте мозжечок между верусом и правым полушарием.

Теперь на вибрато нанесите каплю цианоакрилатного клея на диск для образцов и подождите от 15 до 25 секунд, пока пары растворителя рассеются, прежде чем перенести мозжечок на диск. Далее зафиксируйте край мозжечка к диску образца и подождите 10 секунд. Теперь с помощью манипулятора вставьте диск для образцов в буферный лоток так, чтобы поперечная ось мозжечка была перпендикулярна держателю ножа.

Обязательно закрепите диск с помощью квасцового ключа. Затем тщательно накройте мозжечок HBSS и загрузите колотый лед в охлаждающую ванну. Чтобы разрезать образец, расположите очищенное лезвие так, чтобы его край находился прямо за задним краем образца.

Определите это в качестве отправной точки для обледенения. Затем с помощью команды forward определите конечную точку как сразу за передним краем образца. Теперь установите толщину среза на 180 мкм.

Затем установите скорость секционирования на 2,5 и частоту на восемь и начните секционирование образца. Соберите до пяти ломтиков на мозжечок. Подхватите каждую секцию с помощью усеченной широкой пипетки из кабаньего стекла.

Переложите срезы в посуду с холодным HBSS на лед. Собрав срезы под стереомикроскопом, аккуратно удалите мозговые оболочки с помощью двух щипцов номер пять. Кроме того, аккуратно отделите LOE для лучшей загрузки пробника.

После нарезки образца используйте усеченную широкую пипетку кабана, чтобы перенести их с небольшим количеством HBSS на шестилуночную пластину, загружающую до трех ломтиков в каждую лунку. Далее, после опорожнения среды в каждую загруженную, хорошо добавить пять миллилитров загрузочного раствора, содержащего 10 микромолей флуоресцентного красителя для защиты образцов от света, накрыть пластину фольгой. Затем поставьте пластину на мутатор, установленный на 35 оборотов в минуту.

Дайте планшету поинкубироваться в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы краситель пометил клетки лунок. Теперь перенесите, как и раньше, срезы на мембрану трансвелл-вставки, которая имеет три микронных поры. Затем отсасывайте загрузочную среду, оставив только ломтики.

Теперь вынимаем вкладыш и дольки, чтобы заполнить лунку 1,9 миллилитрами DMEM. Затем положите вкладыш обратно и добавьте еще 100 микролитров DMEM, чтобы покрыть ткани. Инкубируйте этот препарат в течение двух часов, после чего будут видны гранулированные клетки.

Перенесите планшет без крышки в климатическую камеру с постоянным потоком газа на конфокальном микроскопе. Затем поместите стеклянную крышку на пластину конфокального микроскопа для покадровых экспериментов. Дайте клеткам инкубироваться в камере еще два часа, прежде чем продолжить.

Чтобы визуализировать гранулярные клетки, мигрирующие в срезах ткани, осветите препарат светом с яркостью 488 нанометров и используйте двухкратный сухой объектив. Обнаружение флуоресцентного излучения в диапазоне от 500 до 530 нанометров с помощью изображения J. Для каждого изображения цейтраферного фильма выполните проекцию Зака в режиме стандартного отклонения, отрегулируйте уровни контрастности и яркости каждого изображения таким образом, чтобы меченые гранулярные ячейки были легко различимы. Теперь выберите плагин ручного отслеживания в меню анализа частиц.

Используйте плагин, чтобы щелкнуть по центральной точке каждого помеченного тела ячейки на протяжении всей последовательности изображений с интервальной съемкой. Затем экспортируйте необработанные данные отслеживания в электронную таблицу для дальнейшего анализа. Реорганизуйте экспортированные необработанные данные трекинга из Image J с помощью умного самодельного инструмента, который идентифицирует каждую ячейку и связанные с ней позиции с помощью программы.

Рассчитайте общее расстояние перемещения и среднюю скорость миграции для каждой клетки. В раннем постнатальном периоде мозжечка гранулярные клетки демонстрируют значительные изменения в своем способе и скорости миграции по мере того, как они пересекают различные корковые слои. Были исследованы меченые КТГ гранулярные клетки в срезах мозжечковой ткани крысы с ПМ.

Как описано, гранулярные клетки мигрировали радиально в молекулярном слое со средней скоростью 18 микрон в час. Затем был использован другой препарат для проверки действия лекарств, которые, как ожидается, изменят скорость миграции. Применение платного предела 38 к питательной среде привело к снижению скорости гранулярных клеток в молекулярном слое на 79%, до 2,5 микрон в час.

Введение ПИ 1, ингибитора эндогенного ТФК, снижало скорость миграции гранулярных клеток на 78% от контрольной скорости до 4,2 мкм в час. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как отслеживать клетки в развивающемся теоретическом шаре. Когда я пытаюсь провести эту процедуру, важно помнить о том, что необходимо обеспечить соответствующие и постоянные параметры окружающей среды, необходимые для миграции клеток после их развития.

Этот метод проложил путь для исследователей в области нейронаук к изучению фактов процессов в мозге.