Инженерные 3D Cellularized Коллаген Гели для сосудистой регенерации ткани

Общей целью этой процедуры является создание трубчатых конструкций для регенерации сосудистой ткани. Это достигается путем объединения коллагена первого типа и гладкомышечных клеток в цилиндрическую геометрию с использованием техники формования. Второй шаг заключается в созревании конструкции в специально спроектированном статическом биореакторе.

Затем зрелые конструкции тщательно собирают и рассаживают эндотелиальные клетки на просвет конструкции с помощью биореактора с вращающейся стенкой. В конечном счете, гистологические, метаболические анализы и механические тесты проводятся для оценки свойств этих трубчатых конструкций. Оригинальность этой методики заключается в том, что она использует всего один шаг для объединения клеток и коллагена для получения конструкции тканевой инженерии с заданными механическими свойствами без какой-либо дополнительной физической или химической обработки.

Кроме того, конструкцией можно легко манипулировать благодаря специально разработанным рукояткам, которые позволяют манипулировать ими и концевыми звеньями. Этот метод может дать представление о взаимодействии между клетками и внеклеточным матриксом во время роста и ремоделирования для регенерации сосудистой ткани. Кроме того, его можно применять для ряда целевых тканей, таких как сухожилия, кожные трансплантаты, сердечные пластыри и нервная система.

Для начала изготовления и сборки статического биореактора, как описано в сопроводительном текстовом протоколе, в него включены подробные сведения о резервуаре и марле, изготовлении захвата, крышке оправки, а также о сборке формы корпуса и методах стерилизации. Затем расширьте гладкомышечные клетки аорты свиньи в колбе для культуры тканей площадью 175 квадратных сантиметров до тех пор, пока они не станут слившимися на 90%. Используя стандартные методы культивирования, соберите клетки, а затем повторно суспендируйте их в концентрации 4 миллиона клеток на миллилитр в полной питательной среде.

Далее соедините одну часть буферного раствора, две части стерильного раствора коллагена по четыре грамма на литр и одну часть клеточной суспензии. В этом порядке измерьте pH смеси и убедитесь, что он находится в диапазоне от 7,0 до 7,4. Затем аккуратно вливают клеточную коллагеновую смесь в собранный корпус формовочного комплекса.

Следите за тем, чтобы в смеси не было пузырьков воздуха. Дайте коллагеновому гелю постоять при комнатной температуре в течение одного часа в стерильной среде. Через час снимите корпусную трубку и осторожно перенесите конструкцию в резервуар, содержащий 35 миллилитров предварительно прогретой питательной среды.

Инкубируйте конструкцию в вертикальном положении в течение одной или двух недель статического созревания. Меняйте питательную среду каждые два дня, отсасывая старую среду из нижнего порта перегородки и наполняя резервуар эквивалентным количеством свежей культуры. Терпимая. При желании собирайте по одному миллилитру как старой, так и свежей питательной среды на каждой бирже для биохимического анализа каждый час в течение первых 12 часов и каждые 24 часа в дальнейшем.

Извлеките конструкцию из питательной среды в стерильных условиях и поместите ее ортогонально на траекторию сканирующего лазерного интерферометра для измерения толщины конструкции после одной-двух недель статического созревания. Перенесите биореактор в колпак для клеточных культур и аккуратно снимите конструкцию с оправки. Когда он освободится, поместите его в чашку Петри диаметром 100 миллиметров, содержащую 40 миллилитров свежей питательной среды.

Затем установите микромеханический тестер, оснащенный тензодатчиком от 5 до 10 Ньютон и захватами, которые выдвигаются в ванну PBS, поддерживаемую при температуре 37 градусов Цельсия. Извлеките конструкцию из чашки Петри и подключите ее к специализированным захватным устройствам для продольных испытаний, предназначенным для соединения с марлевой частью конструкции без раздавливания геля. Используйте тефлоновую ленту, чтобы предотвратить соскальзывание захватных устройств во время тестирования.

Затем установите конструкцию на микромеханический тестер. Затем проведите усталостное испытание в продольном направлении, сначала растянув конструкцию до исходной расчетной длины и удерживая ее там в течение 10 минут. Затем примените 30 циклических деформаций 10% со скоростью 5% в секунду.

Увеличивайте деформацию с шагом 10% циклической деформации до тех пор, пока образец не сможет выполнять испытания в окружном направлении. Сначала разделите образец на кольцевые конструкции длиной 10 миллиметров. Затем установите кольца на стержни из нержавеющей стали, используемые вместо захватов.

Как и в случае с испытаниями на продольное направление, сначала растяните конструкцию до ее первоначальной расчетной длины и удерживайте ее там в течение 10 минут. Затем примените 30 циклических циклических деформаций 10% со скоростью 5% в секунду. После того как конструкция созреет и будет снята с оправки, зафиксируйте конструкцию, которая оба конца примыкает к резервуару, и поместите ее в узел резервуара.

Как показано здесь. Заполните внешнюю часть водоема 30 миллилитрами культуры. Терпимая. Далее заполните 75% просветного объема конструкции смесью белков, а затем закройте оба конца конструкции.

Чтобы избежать утечки белкового раствора, поместите биореактор внутрь инкубатора и вращайте биореактор в 4,02 умноженных на 10 до отрицательных пяти градусов в течение одного часа, чтобы покрыть поверхность люминала белками во время покрытия люмината. Забор клеток пуповинной вены и щитовидной железы человека культивируется стандартными методами, когда они на 90% конфлюентны, Резус суспензирует клетки и дополнен питательной средой M1 99. Далее осмотрите пупочную вену человека и уротелиальные клетки в просвет конструкции.

При плотности 1000 клеток на квадратный сантиметр закройте верхние концы конструкции, чтобы избежать утечки раствора ячейки. Инкубируйте конструкции, размещенные в культуре биореактора с вращающейся стенкой, в течение двух суток при постоянном вращении в 4,02 раза в 10 раз при отрицательной силе 5G. При статическом созревании сосудистых конструкций внешний диаметр ячеистых подъемных конструкций быстро уменьшается.

Как показано на рисунке, диаметр конструкций уменьшился на 60% от их исходного значения в первый день статической культуры. К седьмому дню конструкции уменьшились почти на 85%.Как продольный, так и окружной циклы деформации конструкций соответствовали вязкоупругим свойствам, типичным для конструкций на основе коллагена. В целом, конструкции были сильнее в продольном направлении по сравнению с окружным направлением в том же диапазоне деформаций, триконное окрашивание Массена, выполненное на эндотелиальных конструкциях, показало высокую однородность эндотелия.

Гладкомышечные клетки демонстрировали веретенообразную морфологию и казались равномерно распределенными по стенке, в то время как эндотелиальные клетки выглядели хорошо распределенными на просветной стороне. После его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области биомеханики и регенеративной медицины к изучению механического поведения искусственных и нативных тканей.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как сосудистые конструкции могут быть быстро спроектированы и в конечном итоге стать достаточно прочными, чтобы их можно было обрабатывать и использовать для механического кондиционирования в динамическом аторе. Мы надеемся, что наши усилия и результаты убедили вас в высоком потенциале клеток в модели внеклеточного матрикса для развития биологических функциональных тканей.