Дифференциация нейронных эмбриональных стволовых клеток мыши в бессывороточной монослоя культуры
14 мая 2015 г.
В этом протоколе подробно описывается метод генерации нейральных предшественников из эмбриональных стволовых клеток с использованием бессывороточного монослойного метода. Эти предшественники могут быть использованы для получения зрелых типов нейронных клеток или для изучения процесса нейронной спецификации и поддаются масштабированию в многолуночном формате для скрининга соединений.
Общая цель данной процедуры заключается в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в клетки нейральной линии в бессывороточной монослойной клеточной культуре. Это достигается путем предварительного покрытия культурального сосуда желатином. На втором этапе эмбриональные стволовые клетки объединяют в суспензию из одиночных клеток в среде для дифференцировки и разводят до соответствующей плотности посева.
На заключительном этапе клетки высевают на планшет, покрытый гелем ENC. В конечном итоге для подтверждения успешности дифференцировки используют иммунофлуоресцентную микроскопию с визуализацией интересующих нейрональных маркеров. Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, могут столкнуться с трудностями, так как соблюдение подходящей плотности при посеве имеет решающее значение для достижения качественной дифференцировки.
Существует несколько факторов, которые прямо или косвенно влияют на плотность посева. Перед посевом клеток прогрейте аликвоту 1% желатина на водяной бане при 37 °C до полного растворения. Затем смешайте желатин с 500 миллилитрами подогретого PBS и залейте дно контейнера для культивирования клеток таким количеством раствора, которое будет достаточно для покрытия поверхности во время нанесения желатина.
Дважды промойте субконфлюэнтную культуру эмбриональных стволовых клеток мыши в PBS. Затем добавьте к культуре один миллилитр реагента для диссоциации. Через две-пять минут постукиванием по сосуду отделите монослой, чтобы получить суспензию из отдельных клеток, и соберите культуру в общий объем 10 миллилитров среды и реагента для диссоциации клеток.
Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл и осадите их в центрифуге. После осторожного аспирирования супернатанта ресуспендируйте осадок в 10 мл предварительно нагретого N2B27, прижимая его к стенке пробирки. Чтобы избежать образования пузырьков, подсчитайте количество клеток, зафиксируйте концентрацию и ресуспендируйте их в предварительно нагретом N2B27 с соблюдением соответствующего количества клеток на единицу объема для каждой лунки согласно таблице.
Затем аспирируйте желатин из культурального сосуда и распределите клетки по планшету, не вращая контейнер. Поместите культуры в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Заменяйте среду каждые один-два дня.
При использовании свежего N2 B27 клетки начнут дифференцироваться и проявят экспрессию SOX2 в течение четырех-шести дней; после этого клетки окрашивают для иммунофлуоресцентной визуализации. Удалите дифференцировочную среду из культур и зафиксируйте клетки в 500 µL 4% параформальдегида. Через 15 минут промойте клетки и проведите их пермеабилизацию дважды, используя по 2 mL PBS с Tween. Затем заблокируйте неспецифическое связывание, инкубируя клетки в течение одного часа.
В одном миллилитре PBS tween с добавлением сыворотки на качалке для планшетов после промывки клеток, как было только что продемонстрировано. Добавьте 500 µL мышиных IgG к бета-3 тубулину в культуры для инкубации в течение ночи на качалке для планшетов при температуре 4 °C. На следующий день.
После промывки клеток инкубируйте образцы с вторичными антителами anti-US IgG, меченными флуорофором, при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение одного часа при постоянном перемешивании на качалке. Снова промойте клетки и окрасьте их в 500 µL DPI в течение пяти минут. Наконец, после последнего промывания клеток, храните их в PBS tween до двух недель при 4 °C.
До проведения визуализации. В данном эксперименте для отслеживания нейральной дифференцировки использовались эмбриональные стволовые клетки мыши с эндогенным GFP-репортером SOX1. На шестой день клетки фиксировали и окрашивали на нейрональный маркер бета-III-тубулин.
При оптимальной плотности клетки дифференцировались в нейральные предшественники и нейроны, тогда как более высокая плотность приводила к уменьшению количества SOX1 GFP- и бета-III-тубулин-положительных клеток. Объем контейнера для культивирования клеток также влияет на оптимальную плотность посева. Например, для клеток, выращиваемых в 96-луночном планшете, требуется плотность клеток примерно в 10 раз выше.
Клетки высевают в шестилуночный культуральный планшет для достижения оптимальной и двух различных плотностей слияния. В процессе дифференцировки эмбриональные стволовые клетки постепенно меняют свою морфологию. Например, на этих изображениях можно наблюдать морфологию клеток и колоний с первого по шестой день после начала дифференцировки при оптимальной плотности клеток.
На четвертый день клетки начинают превращаться в нейральные предшественники, о чем свидетельствует появление зеленого флуоресцентного сигнала репортера SOX 1 GFP. К шестому дню большинство клеток становятся SOX 1-положительными. При этом ожидается наличие некоторых ненейральных клеток. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое понимание того, как инициировать нейральную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток мыши в монослойной клеточной культуре.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе подробно описывается дифференцировка эмбриональных стволовых клеток мыши в нейральные предшественники с использованием метода бессывороточного монослоя. Этот подход позволяет получать зрелые типы нейральных клеток и подходит для масштабирования в многолуночном формате для скрининга соединений.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования стволовых клеток
Обзор
- Эмбриональные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Нейральные предшественники имеют важное значение для изучения развития нервной системы.
- Методы бессывороточного культивирования позволяют повысить воспроизводимость результатов.
- Соблюдение правильной плотности посева критически важно для успешной дифференцировки.
Цель исследования
- Разработать надежный метод получения нейральных прогениторов.
- Облегчить изучение процессов нейральной спецификации.
- Обеспечить возможность проведения высокопроизводительного скрининга соединений, влияющих на нейральную дифференцировку.
Используемые методы
- Покрытие культуральных сосудов желатином.
- Создание суспензии единичных эмбриональных стволовых клеток.
- Посев клеток на покрытые желатином планшеты.
- Использование иммунофлуоресцентной микроскопии для подтверждения успешности дифференцировки.
Основные результаты
- Успешная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в нейральные предшественники.
- Визуализация нейральных маркеров подтверждает дифференцировку.
- Определение оптимальной плотности посева для эффективной дифференцировки.
- Метод масштабируем для применения в скрининге соединений.
Выводы
- Метод получения монослоя в безсывороточной среде эффективен для генерации нейральных предшественников.
- Иммунофлуоресценция является надежным методом оценки дифференцировки.
- Данный протокол может быть адаптирован для различных исследовательских задач в области нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол обеспечивает масштабируемую генерацию нейрональных предшественников из эмбриональных стволовых клеток мыши в определенной безсывороточной монослойной системе, что поддерживает валидацию мишеней на ранних стадиях и снижение механистических рисков при поиске лекарственных средств в нейробиологии. Метод предоставляет воспроизводимую количественную платформу для оценки влияния соединений на нейрональную дифференцировку, облегчая идентификацию соединений-лидеров и повышая прогностическую уверенность в доклинических исследованиях. Совместимость метода с репортерными линиями и форматами культур высокой плотности позволяет интегрировать его в рабочие процессы скрининга для изучения модуляции сигнальных путей и взаимодействия с мишенями.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать механизмы нейрональной спецификации и проводить функциональную валидацию мишеней нейроразвития посредством направленной дифференцировки.
- Практическая ценность: предоставляет определенную безсывороточную систему, которая снижает вариабельность и повышает воспроизводимость результатов в различных экспериментах и клеточных линиях.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать вызванные соединениями изменения выхода нейрональных предшественников и экспрессии маркеров, что дает информацию о взаимодействии с мишенью и модуляции путей.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получать гомогенную популяцию нейральных предшественников, подходящую для скрининга соединений и фенотипической оценки нейральной дифференцировки.
- Практическая ценность: Адаптируемый метод для многолуночных форматов (например, 96-луночных) с возможностью масштабируемой оптимизации плотности посева, что позволяет использовать его в приложениях средней и высокой пропускной способности.
- Готовность к анализу: Совместимость с иммунофлуоресценцией, проточной цитометрией и молекулярными методами анализа для многопараметрической оценки эффективности дифференцировки и экспрессии маркеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет обеспечить переход от генерации нейрональных предшественников к созреванию функциональных нейронов и глии, что способствует моделированию патологических процессов.
- Снижение механистических рисков: облегчает изучение определения клеточной линии и динамики дифференцировки с использованием репортерных линий (например, SOX1-GFP) для мониторинга нейрональной спецификации в режиме реального времени.
- Доклиническая применимость: позволяет оценивать воздействие соединений на созревание нейронов и дифференцировку глии, что поддерживает исследования по фармакологической безопасности и изучению механизмов действия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в цикл ранних этапов поиска, поддерживая валидацию мишеней посредством механистического анализа нейрональной дифференцировки и позволяя разрабатывать аналитические системы для скрининга соединений в рамках нейробиологических портфелей исследований.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о путях нейроразвития и валидацию мишеней с помощью направленной дифференцировки и анализа по маркерам.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализов в монослойной культуре, при этом плотность посева является критическим параметром для стабильного получения нейральных предшественников.
- Аналитика: позволяет получать количественные данные с помощью иммунофлуоресценции (например, SOX1-GFP, βIII-tubulin) и проточной цитометрии для оценки эффективности дифференцировки и ответа на исследуемые соединения.
- Трансляционные исследования: связывает этап получения ранних нейральных предшественников с их последующим созреванием в функциональные нейроны и глию, обеспечивая преемственность на доклиническом этапе.
- Применение в масштабе предприятия: четко определенный масштабируемый протокол позволяет использовать его для различных линий ESC, различных культуральных сосудов и серий скрининговых кампаний, что сокращает трудозатраты на повторную разработку.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в путях нейрональной дифференцировки.
- Операционная ценность: Стандартизированные безсывороточные условия улучшают воспроизводимость и масштабируемость в различных лабораториях и клеточных линиях.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности ранней оценки влияния соединений на определение нейрональной линии и эффективность дифференцировки.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней в области нейробиологии с учетом рисков посредством механистического снижения рисков и валидации путей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, методами дифференцировки и иммунофлуоресцентной микроскопией.
- Необходим доступ к CO2-инкубаторам, центрифугам, микроскопам и таким реагентам, как желатин, N2B27, реагенты для диссоциации и антитела.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется стандартизация плотности посева и процедур покрытия желатином для всех пользователей и центров.
- Адаптация к различным линиям ESC или репортерным конструкциям может потребовать оптимизации плотности посева и сроков дифференцировки.
- Практические ограничения включают чувствительность к плотности посева и необходимость тщательной диссоциации монослоя во избежание образования агрегатов или неполного получения суспензии единичных клеток.
