Водной Микробная Metaproteomics рабочего процесса: от клеток до триптической пептидов Подходит для тандемной масс-спектрометрии на основе анализа

Целью данной процедуры является экстракция белка и ДНК из микробной биомассы из морской воды с последующим получением триптических пептидов для протеомного анализа методом тандемной масс-спектрометрии. Это достигается путем предварительного лизиса клеток, накопленных на картриджном фильтре. На втором этапе лизат клеток концентрируют с использованием ультрацентрифужных фильтрующих устройств.

Затем лизат разделяют на две фракции: одну для осаждения белков, другую — для осаждения ДНК. Заключительным этапом является проведение внутригелевого трипсинового переваривания белков и экстракция пептидов, подходящих для анализа методом жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией. В конечном итоге последующий биоинформатический анализ позволяет идентифицировать экспрессируемые белки в образце, в то время как выделенная ДНК может быть использована для метагеномного анализа и/или анализа гена 16 S-R-R-N-A.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами является возможность одновременного выделения как белка, так и ДНК из одного и того же образца. Для начала удалите раствор для стабилизации РНК из картриджа-фильтра в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл с помощью шприца объемом 60 мл, присоединенного к люэрному замку центрифужного фильтра. Центрифугируйте микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл в течение 10 минут при 17 000 ×g для осаждения клеточного дебриса. Перенесите супернатант в ультрацентрифужный фильтр с пределом отсечения 10 K для улавливания белков, высвободившихся из лизированных клеток образца.

Не утилизируйте осадок. Центрифугируйте ультрацентрифужный фильтрующий блок при 3 270 ×g в течение 30 минут или до тех пор, пока объем не уменьшится примерно до 600 µL. Тем временем расплавьте кончик наконечника P 10 и заблокируйте сторону картриджного фильтрующего блока без люэров открытым концом этого наконечника.

Это гарантирует, что экстракционный буфер и биомасса не вытекут на последующих этапах. Ресуспендируйте осадок в одном миллилитре экстракционного раствора SDS и перенесите его пипеткой в исходный картридж-фильтр. Самый простой способ перенести жидкость в картридж-фильтр — надеть наконечник P 200 на наконечник P 1000 и использовать такую двойную конструкцию для пипетирования. Добавьте в картридж-фильтр еще один миллилитр экстракционного раствора SDS, чтобы общий объем составил около двух миллилитров.

Парафильм. Закройте штуцер Luer-lock картриджного фильтра и поместите его в пробирку объемом 50 мл. Затем положите три скомканных лабораторные салфетки на дно конической пробирки объемом 50 мл.

Закройте крышку и поместите пробирку в печь для гибридизации для инкубации в течение 10 минут при комнатной температуре с перемешиванием. По истечении 10 минут поместите фильтр на пенопластовый поплавок и зафиксируйте его с помощью шприца объемом 5 мл со стороны Luer-lock; инкубируйте в водяной бане при 95 °C в течение 15 минут. Затем дайте картриджному фильтрующему блоку остыть и перемешивайте его при комнатной температуре в течение одного часа. После охлаждения вытолкните раствор для экстракции SDS (лизат клеток) из фильтра с помощью шприца объемом 60 мл в тот же ультрацентрифужный фильтрующий блок.

Как и прежде, добавьте 1 ml свежего раствора для экстракции SDS в картридж-фильтр и перемешайте вручную в течение 30 секунд. Затем с помощью шприца объемом 60 ml вытолкните содержимое фильтра в ультрацентрифужный фильтр, промыв его, чтобы обеспечить полное удаление и сбор всех белков. Центрифугируйте ультрацентрифужный фильтр в течение 45 минут при 3 270 ×g или до тех пор, пока объем в фильтрующем устройстве не станет меньше 600 µL.

Слейте фильтрат и долейте в ультрацентрифужный фильтр свежий раствор для экстракции SDS. Центрифугируйте фильтр еще в течение 45 минут при 3 270 ×g, повторив эту процедуру еще дважды. Убедитесь, что по окончании последнего центрифугирования конечный объем в ультрацентрифужном фильтре не превышает 600 µL.

На этом этапе измерьте объем концентрата и разделите его на две части. Одна фракция будет использована для осаждения ДНК, а другая — для осаждения белка. Для осаждения белка к одному объему концентрата добавьте четыре объема смеси метанола и ацетона в соотношении 50:50, перемешайте на вортексе в течение 10 секунд и инкубируйте в течение ночи при температуре -20 °C.

На следующий день центрифугируйте смесь при 17 000 ×g в течение 30 минут. После декантирования супернатанта высушите осадок в вакуум-концентраторе в течение одного часа. Не пересушивайте осадок, так как это может затруднить его ресуспендирование.

Суспендируйте осадок в 25 µL экстракционного раствора SDS. Оставьте пробу на один час, затем повторно суспендируйте, перемещая жидкость пипеткой вверх и вниз. Выполните SDS-PAGE белков, как подробно описано в текстовом протоколе, работая в шкафу биологической безопасности для минимизации контаминации; для каждой дорожки срежьте излишки геля ниже отметки маркера молекулярных масс 10 kDa.

Каждую дорожку проанализируют на тандемном масс-спектрометре. Отдельно каждую дорожку разрежут на квадраты размером один миллиметр на один миллиметр для увеличения площади поверхности, после чего все квадраты из дорожки поместят в микроцентрифужную пробирку с низкой сорбцией. Повторяя эту процедуру для всех дорожек, можно использовать 1% уксусную кислоту, чтобы предотвратить высыхание геля и затруднение процесса разрезания.

Выполните трипсиновый переваривание в геле и экстракцию пептидов, как описано в текстовом протоколе, либо осаждение ДНК, добавив раствор для экстракции SDS к концентрированной фракции, предназначенной для осаждения ДНК, до отметки 500 µL. Этот шаг предназначен исключительно для увеличения объема раствора, что облегчает дальнейшую работу. Затем добавьте 0,583 объема реагента для осаждения белков, такого как реагент MPC для осаждения белков, и перемешайте на вортексе.

В течение 10 секунд центрифугируйте при 17 000 ×g и температуре 4 °C в течение 10 минут до образования белого осадка. После центрифугирования перенесите супернатант в другую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 0,95 объема изопропанола и переверните пробирку 30–40 раз, затем центрифугируйте в течение 10 минут при 4 °C на максимальной скорости, после чего осторожно слейте и удалите супернатант. Затем дважды промойте осадок 750 µL 70% этанола.

Максимально удалите этанол с помощью пипетки, затем дайте осадку высохнуть на воздухе. Не пересушивайте ДНК, так как это может затруднить её повторное растворение после высыхания. Ресуспендируйте осадок в 25 µL низкотемпературного буфера P8.

Количественно определите содержание ДНК с помощью набора для анализа двухцепочечной ДНК согласно инструкциям производителя. Также проведите электрофорез 3 µL ДНК в агарозном геле для проверки ее качества; пептиды были подвергнуты тандемному масс-спектрометрическому анализу. Для каждого образца было получено более 23 000 спектров, на основании которых были идентифицированы пептиды и белки.

Таксономический и функциональный состав метапротеомов был проанализирован с помощью комбинации blast P и программного пакета metagenome analyzer. Белки, отнесенные к альфа-протеобактериям, были наиболее широко представлены в наборе данных. Подавляющее большинство из них было отнесено к кладе SAR11.

Клада Roter альфа-протеобактерий (Alpha Proteobacteria) также была широко представлена и идентифицирована, чаще всего в поверхностных водах. Белки, относящиеся к бактериальным заболеваниям, были равномерно распределены между поверхностью и максимумом хлорофилла, в то время как белки жгутиковых бактерий в большей степени идентифицировались в области максимума хлорофилла.

Белки гамма-протеобактерий были равномерно распределены по всему водному столбу, в то время как белки бета-протеобактерий обнаруживались преимущественно в поверхностном слое. После освоения эта методика может быть выполнена за три дня при условии правильного проведения.