Применение Долгосрочный культивируют Интерферон-γ фермент-связанного Immunospot анализе для оценки эффекторных и памяти T-клеточные ответы у крупного рогатого скота

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы оценить как эффекторный, так и Т-клеточный ответ памяти с использованием краткосрочного и долгосрочного анализов культивируемого гамма-пятна интерферона соответственно. Оценка центральной реакции памяти осуществляется путем культивирования мононуклеарных клеток периферической крови крупного рогатого скота в условиях антигенной стимуляции в течение 13 дней. Культура длительного времени позволяет эффекторным Т-клеточным реакциям возникать и снижаться.

Интерлейкин 2 добавляют в культуры для поддержания памяти Т-клеток. На 13-е сутки долговременные клетки переносят в пластины L-пятен, покрытые антителами гамма-захвата ИФН. Реакцию долговременных клеток на отдельные антигены микобактерий оценивают либо в присутствии, либо в отсутствии аутологичных антигенпрезентирующих клеток.

APC АПК выделяют из свежих p BMC путем прилипания на 13-й день. Кроме того, реакция свежевыделенного pbmc в условиях ex vivo оценивается как коррелят эффекторных реакций. В нескольких исследованиях было показано, что долгосрочный культивируемый sbot-ответ крупного рогатого скота на антигены микобактерий после вакцинации положительно коррелирует с эффективностью вакцины.

Кроме того, культуры Т-клеток длительного действия содержат в основном центральные Т-клетки памяти как у человека, так и у крупного рогатого скота Для проведения долгосрочного анализа культивируемого L-пятна. 60 мл крови собирают у инфицированных или вакцинированных животных с помощью яремной кости, венепункции и выделяют P BMC по плотности. Градиентное центрифугирование.

Концентрация клеток должна быть скорректирована до 4 миллионов клеток на мл. В полной среде RPMI начинают с осаждения 500 микролитров микробактериальных антигенов, в данном случае TB 10.4 и антигена 85 А, а также очищенного белкового производного культуры em bovis, называемого PPDB. Затем добавьте 500 микролитров pbmc, выделенных от каждого животного, с четырьмя повторами на животное.

Обратите внимание, что все скважины должны быть стимулированы. На этом этапе инкубируйте планшет при температуре 39 градусов Цельсия при нормальной температуре крупного рогатого скота в течение 13 дней. На третий и седьмой дни тщательно сбрасывайте 500 микролитров из каждой лунки, чтобы не нарушить клеточный слой на дне лунок.

Пополняем объем полным PMI, содержащим IL Two. Поместите планшет в инкубатор На 10-й день выбросьте по 750 микролитров надосадочной жидкости из каждой лунки, пополните ее полным РПМИ без всякого ИЛ два, на 12-й день сделайте пипетку и выбросьте по одному мл надосадочной жидкости из каждой лунки, пополненной полным РПМИ без ИЛ два. Также подготовьте пластину для пятна L, которую нужно покрыть антителом IFM Gamma Capture, сначала пипеткой 15 микролитров 35% спирта в каждую лунку с помощью многоканального дозеттера, на этом этапе увеличивается четкость пятна.

Хорошо вымойте шесть раз с 300 микролитрами PBS. Добавьте 100 микролитров антитела захвата в концентрации восемь микрограммов на мл в PBS. Пипетирование следует проводить осторожно во время всех процедур, не допуская соприкосновения кончиков пипеток и не повреждая мембрану на дне лунки, поместите планшет внутрь полиэтиленового пакета и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На 13-й день соберите 60 мл крови с помощью пункции яремной вены у тех же животных, которые были отобраны в первый день. Выделите pbmc и отрегулируйте концентрацию до 2 миллионов клеток на мл. Правильно промаркируйте пластину L для каждого набора образцов.

Долговременные клетки плюс АПК Долговременные клетки без АПК и клетки ex vivo. Выбросьте антитела захвата из точечной пластины Эллиса, промойте лунки с 300 микролитрами PBS, содержащим твин. Повторите шесть раз, выбросьте, промойте жидкость и пипетку.

50 микролитров свежевыделенных p-BMC в лунки, отведенные для долговременных клеток. Плюс БТРы. Заблокируйте другие лунки пластины L-пятна 200 микролитрами на лунку полного RPMI Для оценки фенотипа клеток методом проточной цитометрии параллельно с планшетом для анализа L-точки.

50 микролитров свежевыделенных клеток в правильно маркированном круглом дне 96-луночного планшета. Это вспомогательный анализ, который должен быть выполнен в сочетании с анализом желтого пятна для определения фенотипа реагирующих клеток. Инкубируйте планшеты в течение 90 минут при температуре 39 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% содержанием CO2, позволяя антигенпрезентирующим клеткам прилипнуть.

Также инкубируйте 200 мл полного RPMI, чтобы подогреть его во время этого 90-минутного этапа инкубации. Соберите долгодолго культивируемые клетки из 24-луночного планшета. Объединение четырехугольных дубликатов от каждого животного в одну коническую трубку диаметром 15 мил.

Центрифугируйте пробирки в течение пяти минут при давлении 400 G. Выбросьте надосадочную жидкость путем инверсии пробирки, выбейте клеточную гранулу и добавьте пять мл PBS, при необходимости аккуратно ресуспендируйте гранулу. Промойте клетки дважды, а затем отрегулируйте концентрацию клеток до 200 000 клеток на мл. После 90-минутной инкубации достаньте планшет LPO и полный RPMI из инкубатора.

Поместите пластину LPO на шейкер на 30 секунд. Затем удалите неприлипшие клетки пластинчатой инверсионной пипеткой 150 мкл на лунку теплой полной РПМИ. Встряхните пластину и слейте промывочную жидкость.

Повторите три раза, слейте как можно больше жидкости и добавьте по сто микролитров каждого антигена в соответствующие лунки, содержащие адгезивные АПК. Затем пипеткой по 100 микролитров на лунку длительно культивируемой клеточной суспензии. 200 000 клеток на мл в лунки, помеченные как долговременные клетки плюс APC.

Убедитесь, что долговременные клетки, добавленные на этом этапе, принадлежат тому же животному, что и APC, уже находящиеся в скважине. Не смешивайте АПК и долговременные культивируемые клетки разных животных. Также пипетку по 100 мкл на лунку долговременной культивируемой клеточной суспензии в концентрации 200 000 клеток/мл в лунки без АПК для оценки долгосрочных ответов.

При отсутствии антигенной презентации добавьте 100 микролитров на лунку краткосрочных клеток, а также свежевыделенные и скорректированные до 2 миллионов клеток на мл для оценки ответа ex vivo. При проведении анализа проточной цитометрии промыть круглое дно 96, луночный планшет и добавить в лунки свежевыделенные клетки и антигены длительного действия, следуя той же процедуре. Используется для инкубации планшетов IFN Gamma LPO в течение ночи при температуре 39 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% содержанием CO2.

Следите за тем, чтобы тарелки лежали ровно и не складывайте тарелки на 14 день. Слейте жидкости из лунок и промойте пластины шесть раз по 300 микролитров на лунку PBS, содержащего подростка, поместите его на шейкер для тарелок каждый раз на 10 секунд до и между промывками. Затем промойте один раз тем же объемом дистиллированной воды и еще шесть раз с PBS, содержащим подросток.

Наконец, дважды промойте ячейки 300 микролитрами на лунку PBS. Удалите жидкость для стирки, постучав по пластине по бумажным полотенцам или впитывающим салфеткам. Добавьте 100 микролитров на лунку обнаруживаемого антитела в дозе пять микрограммов на мл, разведенных в PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина.

Инкубируйте планшеты в течение 120 минут при температуре 39 градусов Цельсия. На этом этапе инкубации приготовьте раствор щелочной фосфатазы из стандарта набора VTA Stain A BC AP в соответствии с инструкциями производителя за 30 минут до использования или через 90 минут после добавления в лунки обнаруживающих антител. Разведите реагент в PBS-содержащем твинде после 120-минутной инкубации, отбросьте обнаруженные антитела с помощью планшетов для инверсии промывки шесть раз по 300 микролитров на лунку PBS-содержащего твина.

Удалите жидкость для стирки, постучав по тарелке по бумажным полотенцам. Затем добавьте 100 микролитров на лунку раствора щелочной фосфатазы. Выдержите пластины в течение 45 минут при комнатной температуре.

Слейте жидкость и промойте каждую пластину шесть раз с помощью PBS Containing tween. Приготовьте раствор субстрата из трех комплектов субстрата vector blue AP, следуя инструкциям производителя. Разведите реагенты в 0,1 молярном трис гидрохлоридном буфере при pH 8,2.

Пипеткой 50 микролитров субстрата D. Каждую лунку инкубировать при комнатной температуре до тех пор, пока синий цвет не начнет развиваться примерно через 30 минут. Слейте жидкость и промойте тарелки большим количеством дистиллированной воды. Снимите нижнюю пластину, чтобы обнажить мембрану, промойте ее обратно в лунки и дайте пластине высохнуть на воздухе.

Измерьте реакцию с помощью иммуноточечного анализатора или держите планшеты в темноте при комнатной температуре, пока не будет измерена реакция. Благодаря высокой стабильности реакции качество субстрата сохраняется в течение нескольких лет. При оценке фенотипа и цитокинового ответа методом проточной цитометрии проводят стандартные процедуры окрашивания клеток, покрытых на круглом дне 96, хорошо показывают репрезентативную ТКМ планшета в присутствии или отсутствии АПК, пилотируемые ex vivo ответы гамма-L-пятна ИФН ИФН от инфицированных животных и неинфицированных животных.

Специфические реакции на m bovis оценивают с помощью антигенной стимуляции PBDB или ESAT six, CFP 10. Пятна на нижней части пластин являются цветным продуктом анализа на желтое пятно. Каждое пятно обычно представляет собой отдельную цитокин-продуцирующую клетку, обеспечивая количественное измерение Т-клеток, продуцирующих ИФН гамма, с клетками инфицированных животных.

Долгосрочные реакции гамма-L-пятен ИФН, представленные в виде пятнообразующих клеток или SFC, четко визуализированы: продукция гамма-излучения ИФН в ответ на стимуляцию антигена практически отсутствует; с клетками неинфицированного крупного рогатого скота и с нестимулированными клетками инфицированного или неинфицированного крупного рогатого скота. Устойчивый Т-клеточный ответ должен возникать в ответ на митоген сорняков, как показано в TCM и ex vivo ответах на PPDB и ESAT 6. CCFP 10 были обнаружены у всех животных, инфицированных 3М бовис, и у контрольного животного были обнаружены минимальные или отсутствующие ответы ТКМ и ex vivo.

Присутствие АПК требовалось для оптимального ответа ТКМ инфицированных животных, о чем свидетельствует значительное снижение реакции долговременных культивируемых клеток. В отсутствие аутологичных АПК были представлены пятнообразующие клетки от эм, инфицированных и неинфицированных животных. Количество SFC от каждого животного рассчитывали по среднему количеству SFC от 10 до 6 клеток в дубликатах образцов в ответ на PPDB за вычетом соответствующего ответа только на среду, который различался в зависимости от статуса инфекции, наличия или отсутствия APC и длины культивирования, т.е. долгосрочная культура по сравнению с культурой ex vivo.