В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК

Общая цель этой процедуры заключается в локализации бактерий в залитых парафином тканях с помощью меченой 16 s рибосомальной РНК DIG, нацеленной на зонды ДНК. Это достигается путем предварительной подготовки зонда с амплификацией ПЦР и маркировкой DIG. Вторым шагом является подготовка участков ткани к более доступным целевым участкам и меньшему связыванию фона.

Далее подготовленные срезы ткани гибридизуются с помощью зонда, помеченного копанием. Наконец, гибридизированный зонд детектируется щелочной фосфатазой, меченой антителами anti-D dig. В конечном счете, этот метод гибридизации С-2 может показать присутствие бактерий с тканями, залитыми парафином.

Преимущество этого метода по сравнению с существующим методом, таким как ING, заключается в том, что этот метод может обнаруживать бактерии SHS в контексте некоторых гистологических структур. Этот метод может дать представление о патогенезе, но может привести к различным воспалительным заболеваниям, таким как пародонтит и R-планета. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки тканей и гибридного пищеварения сложны в выполнении из-за того, что участки ткани легко повреждаются.

Чтобы заставить зонд U-бактерий использовать 70 пару оснований, фрагмент ДНК в качестве матрицы и два праймера 15 пар оснований для амплификации зонда методом ПЦР. Соберите ампликон в буфер в известной концентрации. Затем пометьте зонд с помощью набора для маркировки и обнаружения ДНК DIG.

Сначала смешайте три микрограмма щупа с 15 микролитрами воды. Денатурируйте зонд в тепловом блоке в течение 10 минут при температуре 95 градусов Цельсия. Затем положите денатурированный щуп на лед.

Затем добавьте два микролитра 10 нуклеотидов XH, два микролитра DN NTP и один микролитр фермента канала. После смешивания дайте зонду инкубироваться при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24–48 часов. Остановите реакцию, нагрев смесь до 65 градусов Цельсия.

Затем измерьте концентрацию ДНК меченого зонда на уровне 260 нанометров и отрегулируйте концентрацию до 100 нанограммов на микролитр. С помощью набора проверьте чувствительность щупов сначала на нейлоновую мембрану, загрузив один микролитр серийно разбавленного положительного контроля. Зонд и копать маркированный щуп.

Дайте мембране высохнуть в течение пяти минут. После высыхания ненадолго окуните мембрану в два XSSC, а затем перенесите ее в инкубатор с температурой 80 градусов Цельсия на час. Чтобы обездвижить ДНК после инкубации, кратковременно замочите мембрану в буфере малеиновой кислоты, а затем перенесите ее в блокирующий буфер, концентрированный с конъюгированными антителами AP в разведении от 1 до 5000 через полчаса.

Промойте мембрану в MABT. Затем смешайте 40 микролитров N-B-T-B-C-I-P с двумя миллилитрами буфера обнаружения. А после ванны добавить эту смесь на пленку на одну минуту.

После удаления парафина и регидратации участков тканей, как описано в текстовом протоколе, подготовьте их к двум гибридизациям, сначала погрузите предметные стекла в 0,1 нормальной соляной кислоты на 20 минут. После принятия кислотной ванны смойте предметные стекла водой, обработанной DEPC, в течение 30 секунд. Затем с помощью восковой ручки наметьте образцы на каждом предметном стекле.

Далее добавьте к образцам от 50 до 400 микролитров раствора протеиназы К, в зависимости от их размера. Дайте ферменту поработать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия, а затем промойте предметные стекла в обработанном DEPC одном XPBS в течение одной минуты. Теперь переведите предметные стекла на 4%-ный параформный альдегид в обработанный DEPC PBS на 10 минут.

Смойте фиксатор PBS, как и раньше. Затем окуните предметные стекла в 0,1 молярного триэтаноламина гидрохлорида при pH восьмерке с 0,5% уксусной и гидридной кислотой через 20 минут, смойте горки чистой водой, как и раньше. Теперь начните в C two, сначала погрузив слайды в два XSSC на 20 минут.

Тем временем разбавьте меченный зонд до одного нанограмма на микролитр в буфере для гибридизации для отрицательного контроля. Используйте концентрацию, в 10 раз превышающую концентрацию зонда без маркировки. Затем денатурируйте зонды, нагрев их до 90 градусов Цельсия в течение 10 минут, а затем быстро охладите их на льду.

Затем нанесите на каждое предметное стекло тот же объем разведения зонда, что и протеиназу К, который был применен ранее. Затем тщательно покройте участки скольжения и запайки лаком для ногтей. Теперь нагрейте предметные стекла на блоке ПЦР-машины при температуре 90 градусов Цельсия в течение 10 минут и перенесите их в увлажненный инкубатор с температурой 45 градусов Цельсия на ночь на следующий день.

Охладите горки вниз до четырех градусов Цельсия в течение получаса, а затем аккуратно снимите крышку стекла. Ткани хрупкие. Наконец, пропустите предметные стекла через ряд буферов SSC при комнатной температуре.

Сначала промойте NC двумя гибридизованными предметными стеклами в течение пяти минут в MABT. Затем нанесите от 50 до 400 микролитров блокирующего раствора в 1%-20 минут на 20 минут. После инкубации блока применяют от 50 до 400 микролитров от одного до 1000 анти-Д дина щелочного фосфатазы антител и блокирующего раствора.

Дайте ему закрепиться в течение 90 минут при температуре 37 градусов Цельсия после нанесения первичного средства. Промойте горки в MABT в течение 10 минут. Затем на пять минут поместите предметные стекла в буфер обнаружения с 1% tween 20.

Теперь нанесите от 50 до 400 микролитров одного миллимолярного оле в буферном растворе для обнаружения на каждое предметное стекло и инкубируйте их в течение пяти минут, чтобы инактивировать эндогенную щелочную фосфатазу. Далее добавьте от 50 до 400 микролитров N-B-T-B-C-I-P, разведенных в детекции. Буферизуйте от одного до 100 к каждому предметному стеклу и дайте предметным стеклам инкубироваться в течение двух-трех часов во влажной камере, основываясь на опыте.

Промойте предметные стекла деионизированной водой, затем нанесите метиловый зеленый в дозе 0,05% по объему и дайте противоотверженному пятну подействовать на ткани в течение 10 минут. При 37 градусах по Цельсию. Снова промойте стекла деионизированной водой, а затем обезвожьте их 100% этанолом, а затем окуните в ксилол.

В конце нанесите 80 микролитров монтажного материала и защитите крышку. Слайды после выкапывания были помечены маркировкой. Их чувствительность сравнивали с разведением положительного контрольного зонда.

Специфический зонд с 3 43 парами оснований p gingivalis был в 25 раз более чувствительным, чем разработанный зонд для бактерий с 70 парами оснований. Затем два зонда были применены к тканям десен у пациентов с хроническим периодонтитом в большом увеличении. Различные формы бактерий были различимы с помощью бактериального зонда.

В то время как специфический зонд p. gingivalis обнаруживал только палочковидные бактерии, на слизистую оболочку десен мышей было нанесено плотное соединение, разрушающее химическое вещество DSS. Образцы тканей этих мышей были использованы для сравнения зондов в другом контексте. Здесь бактериальный зонд U смог обнаружить бактерии, которые не смог обнаружить другой человек.

Затем зонд U-бактерий был проверен на его способность обнаруживать другие бактерии в срезах легочной ткани, содержащих опухоли. Бактерии были обнаружены как снаружи опухоли, так и внутри опухоли. При исследовании тканей пациентов с красным плоским лишаем полости рта, заболеванием неизвестной этиологии, бактериальный зонд обнаружил бактериальные сигналы в клетках собственно эпителия и собственной пластинки, где наблюдалась воспалительная инфильтрация.

С момента своего развития эта методика помогла исследователям в области инфекционных заболеваний изучить инвазию бактерий в ткани как у человека, так и у животных после этой процедуры. Другие методы, такие как иммунохимическое обнаружение роста к клеточным маркерам, могут быть ЭД для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие клетки содержат бактерии в тканях.